WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 


«Министерство образования и науки Российской Федерации МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (государственный университет) ФАКУЛЬТЕТ ОБЩЕЙ И ПРИКЛАДНОЙ ФИЗИКИ КАФЕДРА ФИЗИКИ И ТЕХНОЛОГИИ ...»

Министерство образования и науки Российской Федерации

МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

(государственный университет)

ФАКУЛЬТЕТ ОБЩЕЙ И ПРИКЛАДНОЙ ФИЗИКИ

КАФЕДРА ФИЗИКИ И ТЕХНОЛОГИИ НАНОСТРУКТУР

(Бакалаврская программа «Прикладные математика и физика»)

Определение структуры белков и поиск оптимальных условий

образования липидных кубических фаз с помощью метода малоуглового рассеяния Бакалаврская диссертация студента 025 группы Власова Алексея Валерьевича Научный руководитель Куклин А.И., к.ф.-м.н.

г. Долгопрудный Оглавление 1 Введение 4

1.1 Актуальность проблемы

1.2 Объекты исследования

1.3 Цели и задачи

2 Обзор литературы 9

2.1 Апоферритин и ферритин

2.1.1 Распространённость в природе

2.1.2 Структура и форма белка

2.1.3 Функции белка и его роль в организме

2.2 Липиды

2.2.1 Типы липидных структур

2.2.2 Фазовые диаграммы для липидов

2.2.3 Липидные кубические фазы

3 Материалы и методы 21

3.1 Приготовление образцов

3.1.1 Серия концентраций апоферритина

3.1.2 Липидные фазы

3.2 Методы исследования липидов и белков

3.2.1 Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

3.2.1.1 Рассеяние плоской монохроматической волны

3.2.1.2 Преобразование Фурье. Свёртка функций

3.2.1.3 Корреляционная функция

3.2.1.4 Интенсивность рассеяния для простых геометрических тел............ 33 3.2.1.5 Инвариант Порода

3.2.1.6 Приближения Гинье и Кратке

3.2.2 Малоугловое рассеяние нейтронов

3.3 Методы исследования взаимодействия белков

–  –  –

4.1.1 Данные с синхротрона ESRF

4.1.2 Данные с установки ЮМО ИБР-2 ОИЯИ

4.1.3 Данные с дифрактометра Ригаку МФТИ

4.2 Анализ данных малоуглового рассеяния

4.2.1 Сравнение данных с различных установок

4.2.2 Структурный фактор и анализ взаимодействия белков в растворе........... 52

4.3 Измерение липидных фаз методом МУР

–  –  –

Глава 1 Введение

1.1 Актуальность проблемы В настоящее время исследование рецепторов, сопряжённых с G-белком (англ. – G protein-coupled receptors) (GPCRs), является приоритетным направлением в развитии биотехнологий. Известно, что нарушения в работе GPCRs приводит к возникновению широкого спектра заболеваний, а сами GPCRs являются мишенью для 40% производимых лекарств.[1] Исследование GPCRs даже на сегодняшний день представляет собой непростую задачу и связано со многими трудностями. Сложность исследования обусловлена тем, что GPCRs являются интегральными белками, то есть, они встроены в клеточные мембраны.

Отсюда следует необходимость в создании весьма специфичных условий для их кристаллизации, что требует многопараметрического анализа и огромной точности постановки эксперимента.

Кристаллизация GPCRs необходима для расшифровки структуры белков методом рентгеновской дифракции. Расшифровка структуры, в свою очередь, необходима для понимания структурных и функциональных особенностей работы белков, исследования взаимодействий их с потенциальными кандидатами на лекарства и отбор наиболее эффективных лекарственных препаратов.

Параллельно с исследованием GPCRs сегодня наблюдается бурное развитие теоретических моделей, призванных объяснить кинетику кристаллизационных процессов, а также влияние различных параметров на скорость кристаллизации.

Так, например, идёт исследование возможностей кристаллизации белков в липидных кубических фазах.[2] Весь комплекс исследований направлен на оптимизацию процесса расшифровки структур белков, поэтому в данный момент времени идёт развитие не только теоретической базы, но и экспериментальных методов исследования белковых структур, в том числе и метода малоуглового рассеяния рентгеновского излучения (МУРР) и малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН).

Современные установки МУРР и МУРН позволяют исследовать взаимодействие между белками, находящимися как в растворе, так и в мембранах. Дело в том, что для более глубокого понимания структурных особенностей тех или иных белков необходимо не просто решить их структуру, но также понять, каким образом белки взаимодействуют между собой в растворе и в мембране. Сегодня это с хорошей точностью способны определить установки малоуглового рассеяния (МУР).

Также современные МУР сегодня призваны решать широкий спектр задач, начиная от определения фазового состояния вещества и заканчивая определением интегральных параметров, характерных геометрических размеров, а также решением структуры белков с точностью 5 [3].

Например, одним из таких белков является апоферритин. Это не мембранный белок, но его исследование с точки зрения метода МУР является удачным индикатором разрешения установки по модулю вектора рассеяния. С помощью такого белка можно отрабатывать методики определения структуры низкого разрешения.

Также апоферритин представляет интерес и с медицинской точки зрения, так как является кандидатом на опухолевый маркер [4], маркер биологического возраста человека [5], а также является компонентом для создания вакцины против широкого спектра заболеваний вирусом гриппа [6]. Кроме того, белок интересен и с точки зрения понимания механизма обмена железом в организмах многих эукариотов.

Для решения данных задач постоянно совершенствуются и развиваются установки малоуглового рассеяния.

1.2 Объекты исследования Объектами исследования в данной работе являются белок апоферритин и липидные кубические фазы.

Дело в том, что для исследования взаимодействия мембранных белков необходимо вначале понять, как взаимодействуют между собой не мембранные белки, и апоферритин здесь является хорошим объектом для исследования.

Апоферритин – это белковая оболочка вокруг ферроксидазного ядра белкового комплекса ферритин. Он является одним из жизненно-важных белков в любом типе клеток. Его роль заключается в сохранении и распределении железа в организме.

Изучение липидных кубических фаз, а точнее, поиск условий для их образования – является неотъемлемой и крайне важной частью этой работы, так как изучение взаимодействия мембранных белков в мембране невозможно без глубокого понимания процессов, происходящих в самой мембранной оболочке, а именно, поведение липидов в разных фазовых состояниях и их взаимодействие между собой.

Поэтому, в данной работе представлены результаты по исследованию апоферритина, и липидных кубических фаз, что является частью более общей задачи по изучению взаимодействия мембранных белков непосредственно в мембранных оболочках, и хорошим кандидатом для исследования процессов, происходящих в мембране, является интегральный мембранный белок – бактериородопсин.

Изучение бактериородопсина, его поведения при различных условиях и конформационных изменений, происходящих с ним в фотоцикле должны пролить свет на некоторые процессы, происходящие в клеточной мембране, что также является актуальной задачей для широкого спектра областей, начиная с разработок светочувствительных приборов, и заканчивая диагностикой зрения в медицине.

На Рис. 1 представлено схематическое описание уже проделанной работы, а также более общая задача, частью которой она является.

На Рис. 1 показано, что исследование бактериородопсина является связующим звеном для полноценного охвата всех аспектов такой глобальной задачи, как исследование процессов взаимодействия мембранных белков между собой, взаимодействия мембранных белков и липидов в мембранах, а также поиск необходимых условий для кристаллизации мембранных белков с использованием метода на основе липидных кубических фаз, предложенного в работе [2].

Все вышеперечисленные факторы и определили объекты исследования в данной работе. Так, апоферритин был выбран из-за наличия достаточного большого количества работ по данному белку, что позволило использовать его в качестве проверки корректности методики анализа данных МУР. Липидные кубические фазы исследовались для оптимизации кристаллизационного процесса, как самые перспективные и многообещающие на сегодняшний день условия для кристаллизации белков.

Причём, для выбора как апоферритина, так и липидных кубических фаз в качестве объектов для исследования, сыграло не последнюю роль наличие для них целого ряда вопросов, которые и по сей день остаются открытыми. Так что данная работа не только является частью более глобальной задачи по изучению структурного и конформационного устройства мембранных белков, но также имеет научную новизну на каждом этапе исследования.

Рис. 1. Схематическое изображение проделанной работы (отмечено «галочкой»), а также концепции более глобальной задачи.

1.3 Цели и задачи Целью исследования является определение структуры белков и поиск оптимальных условий образования липидных кубических фаз с помощью метода МУР.

Задачи, поставленные в настоящей работе, являются частью исследования взаимодействия мембранных белков.

В данной работе были поставлены следующие задачи:

По методу МУР: сравнение данных МУР, полученных на трёх различных установках МУР (BM-29 ESRF, Grenoble, France; ЮМО ИБР-2, ОИЯИ, Дубна, Россия; Ригаку, МФТИ, Долгопрудный, Россия) для одних и тех же образцов (серия концентраций апоферритина).

Для апоферритина: определение интегральных параметров и характерных геометрических размеров белка. Вычисление структурного фактора и выявление характерных особенностей поведения белка в водном растворе.

Для липидов: поиск липидов, образующих липидные кубические фазы при некотором наборе параметров системы, определение данных параметров, а также количественное определение параметров решётки в липидных кубических фазах.

Глава 2 Обзор литературы

2.1. Апоферритин и ферритин Апоферритин – белок, способный к связыванию железа в виде комплексного соединения его гидроокиси и фосфорной кислоты. Обеспечивает всасывание железа в кишечнике, а также депонирование железа в организме; содержится в печени, селезёнке и слизистой оболочке кишечника. [7 – 9] Ферритин – глобулярный белковый комплекс, состоящий из 24 субъединиц и выполняющий роль основного внутриклеточного депо железа. У млекопитающих существуют два типа субъединиц, объединяющихся в ферритин, — H, содержащая ферроксидазный сайт, и L, форма которой способствует обработке железа в этом сайте. Благодаря ферритину цитозольные запасы железа поддерживаются в растворимой и нетоксичной форме. [10]

2.1.1. Распространённость в природе

Исследования апоферритина и ферритина начались в 1937 году, когда в своей работе [11] Laufberger показал наличие апоферритина не только в селезёнке лошади, но также и в её печени. Это послужило первым толчком для предположения о наличии апоферритина в разных органах, причём не только лошади, но и всех млекопитающих в принципе, в том числе и в человеке.

Это и было отчасти подтверждено уже в 1943 году в работе [12], где апоферритин был выделен из различных органов для ряда млекопитающих, в том числе и человека. (см.

Рис. 2)

–  –  –

На данный момент нашла экспериментальное подтверждение теория о повсеместной распространённости ферритина в самых различных органах для всех млекопитающих. [13 – 16] 2.1.2. Структура и форма белка В 1963 году, в работе [17] было сделано предположение о структуре апоферритина.

Исходя из данных малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУРР), были вычислены характерные параметры апоферритина: молекулярный вес, равный 480 кДа, а также радиус внешней оболочки – (61 ± 3).

Из данных рентгеновской дифракции было вычислено, что ячейку кристалла апоферритина образуют четыре молекулы, и её размер – 184, тип симметрии – F432.

Также, было определено, что свободный от железа апоферритин кристаллизуется аналогично ферритину – белку, содержащему железо.

Из предположений о том, что у апоферритина примерно 20 субъединиц, была предложена структура белковой молекулы, где каждая субъединица представлена шаром (см. Рис. 3)

–  –  –

На самом деле оказалось, что апоферритин состоит из 24 субъединиц, что впервые было показано в работе [18].

В 1994 году вышла работа [19], где опубликованы результаты расшифровки структуры апоферритина с точностью 2.6. Структура также опубликована на сайте Protein Data Bank [20]. Решение структуры производилось методом рентгеновской дифракции на кристалле апоферритина. При кристаллизации были использованы вспомогательные вещества: и протопорфирин IX ( ) – его структурная формула представлена на Рис. 4.

–  –  –

На Рис. 5.а показано, что мономер апоферритина состоит из четырёх альфа спиралей и ещё некоторых частей, но вовсе не является шаром, как предполагалось ранее в работе [17].

Также, из вида решённой структуры следует, что у молекулы апоферритина имеются двух, трёх и четырёхфолдные каналы (см. Рис. 5.в–д), а форма белка представляет собой додекаэдр, собранный из 24-х одинаковых субъединиц.

Однако, остаётся открытым вопрос о соответствии решённой структуры апоферритина в кристалле с той, которая наблюдалась бы в более естественных для белка условиях, например, в растворе.

Рис. 5. Схематическая структура апоферритина. a) – структура одного мономера апоферритина, б) – структура молекулы апоферритина целиком. Структура апоферритина: в) – четырёхфолдный канал в центре, г) – трёхфолдный канал в центре, д) – двухфолдный канал в центре. [20] 2.1.3. Функции белка и его роль в организме В организме апоферритин выступает в роли хранилища железа. В работе [21] утверждается, что одна молекула белка может содержать до 4500 атомов железа.

Кинетика поглощения апоферритином железа подробно описана в работе [21]. На Рис. 6 показано поглощение апоферритином железа в зависимости от времени.

Рис. 6. График поглощения апоферритином железа от времени. По вертикальной оси отложена концентрация железного ядра в мкмоль/мл, по горизонтальной – время в минутах. Сплошная линия – экспериментальная кривая. Прерывистая линия – теоретическая кривая. [21] Для построения теоретических кривых была использована модель роста кристаллов с учётом того, что скорость поглощения железа апоферритином зависит от изначального количества железа в молекуле белка.

В работе [22] показано, что апоферритин выполняет также и каталитическую функцию в начале процесса формирования ферроксидазного ядра внутри белковой оболочки.

Работа [23] показывает, что апоферритин является белком, устойчивым в очень широком диапазоне pH – от 3.4 до 10.

Работы последних лет подтверждают теорию о том, что апоферритин выполняет функцию хранилища железа в организме. Однако до сих пор остаётся открытым вопрос о взаимодействии белков между собой в растворе, о существовании процессов вывода железа из молекулы ферритина и о наличии у белка других функций, помимо хранения и метаболизма железа.

2.2. Липиды

Липиды – обширная группа природных органических соединений, включающая жиры и жироподобные вещества. Молекулы простых липидов состоят из спирта и жирных кислот, сложных – из спирта, высокомолекулярных жирных кислот и других компонентов. Содержатся во всех живых клетках [24]. Будучи одним из основных компонентов биологических мембран, липиды влияют на проницаемость клеток и активность многих ферментов, участвуют в передаче нервного импульса, в мышечном сокращении, создании межклеточных контактов, в иммунохимических процессах [25].

Также липиды образуют энергетический резерв организма, участвуют в создании водоотталкивающих и термоизоляционных покровов, защищают различные органы от механических воздействий и др. [24]. К липидам относят некоторые жирорастворимые вещества, в молекулы которых не входят жирные кислоты, например, терпены, стерины.

Многие липиды – продукты питания, используются в промышленности и медицине [24].

Согласно нестрогому определению, липид — это гидрофобное органическое вещество, растворимое в органических растворителях; согласно строгому химическому определению, это гидрофобная или амфифильная молекула, полученная путём конденсации тиоэфиров или изопренов [26].

Поскольку липиды имеют гидрофобную и гидрофильную части (см. Рис. 7а, б), они способны к структурообразованию в воде.

Рис. 7. а) Схематическое изображение липидов [27], б) – Пример структурной формулы липидов. На данном рисунке изображена структурная формула сфингомиелина.

Липиды могут иметь два или даже три углеводородных хвоста. Именно липиды с двумя углеводородными хвостами – наиболее распространённые липиды в биологических мембранах.

При помещении липидов в водную среду, в зависимости от соотношения объёмов липид/вода, они способны к образованию нескольких фаз и структурной организации.

2.2.1 Типы липидных структур

Выделяют несколько характерных типов структурной организации липидов:

Мицеллы – агрегаты, имеющие сферическую форму, в которых липиды обращены полярными головками наружу, а гидрофобными хвостами внутрь (см. Рис. 8.а).

Обращённые мицеллы – структуры, которые образуют липиды, помещённые в неполярную среду. Как и мицеллы, имеют сферическую форму, но липиды обращены полярными головками внутрь, а гидрофобными хвостами наружу.

Фактически, это мицеллы, «вывернутые наизнанку» (см. Рис. 8.б).

Двойные слои (бислои) – бимолекулярные слои липидов, обращённых полярными головками наружу, а гидрофобными хвостами внутрь (см. Рис. 8.в).

Бицеллы – структуры, возникающие при добавлении детергента (липидов с короткими углеводородными хвостами) к водному раствору липидных бислойных мембран, и представляющие собой части этих мембран, с торцов окружённые детергентом (см. Рис. 8.г).

Липосомы – замкнутые бислои, имеющие более-менее сферическую форму. Могут быть как однослойные (из одного бислоя), так и многослойные липосомы, состоящие из вложенных друг в друга бислойных оболочек (см. Рис. 8.д).

Стоит отметить, что фазы и структурная организация липидов зависит как от свойств среды, так и от свойств самих липидов, погружённых в неё. Так, например, липиды с двумя гидрофобными хвостами, будучи погружённые в водный раствор, не смогут образовать такие структуры, как бицеллы, потому что радиус кривизны поверхности около краёв бицеллы гораздо меньше радиуса кривизны поверхности, которую способны образовать липиды с двумя хвостами, из которых состоит тело бицеллы – липидный бислой.

Поэтому для образования таких липидных структур как бицеллы необходимо добавить в раствор не только исходных липидов с двумя хвостами, но также и детергента

– липидов с одним коротким хвостом, которые способны к образованию поверхностей с меньшим радиусом кривизны – это и позволяет «замкнуть» края бислоя и образовать бицеллу, как показано на Рис. 8.г.

Рис. 8. Схематическое изображение а) мицеллы, б) обращённой мицеллы, в) бислоя, г) бицеллы, д) однослойной липосомы.

2.2.2 Фазовые диаграммы для липидов В зависимости от соотношения липид/вода, температуры, и прочих условий могут наблюдаться различные фазовые состояния вещества.

Самый яркий пример того, насколько сложной может быть фазовая диаграмма даёт смесь воды и моноолеина.

Моноолеин – это моноглицерид с ненасыщенным углеводородным хвостом, водные суспензии которого формируют большое разнообразие мезофаз. На Рис. 9 представлена его структурная формула.

В 1996 году опубликована работа [28], где подробно изучены мезофазы для этого липида и построена его фазовая диаграмма в широком диапазоне температур (см. Рис. 10).

–  –  –

Рис. 10. Фазовая диаграмма для системы моноолеин/вода. По горизонтальной оси отложено процентное отношение воды по массе. По вертикальной – температура в градусах Цельсия. [28] Подобного рода фазовые диаграммы можно построить и для других липидов. В настоящей же работе представляют интерес так называемые липидные кубические фазы, то есть фазы с симметрией Pn3m, Ia3d, или другими типами симметрий, но образующие кубическую решётку.

2.2.3 Липидные кубические фазы В 2009 году вышла работа Черезова В. [29], где был подробно описан протокол по кристаллизации мембранных белков в липидных кубических фазах. В качестве липида, образующего липидные кубические фазы, был выбран всё тот же моноолеин.

Рассмотрим более детально его фазовую диаграмму, представленную на Рис. 11.

Рис. 11. Фазовая диаграмма для системы моноолеин/вода. Жидкокристаллические фазы при температуре ниже 17 метастабильны, Ia3d и Pn3m – кубические фазы. [29] Из Рис. 11. следует, что при комнатной температуре и в избытке воды моноолеин образует биконтинуальные кубические фазы. В той же работе [29] описывается протокол по кристаллизации в таких липидных кубических фазах мембранных белков, а также выдвигается гипотеза о кинетике кристаллизации, схематично изображённой на Рис. 12.

Аналогичная, но немного более подробная схема для кинетики кристаллизационного процесса мембранных белков в липидных кубических фазах представлена в работе [30], (см. Рис. 13).

Рис. 12. Схематическое изображение кинетики кристаллизационного процесса мембранных белков в липидных кубических фазах.[29] Рис. 13. Гипотеза о процессе формирования трёхмерных кристаллов и схематическое изображение кинетики кристаллизационного процесса мембранных белков в липидных кубических фазах. [30] Приведённые выше работы показывают, что протоколы для кристаллизации мембранных белков подробно описаны не только с практической, но и теоретической стороны. Тем не менее, остаётся ещё целое поле для исследований, направленных на более подробное изучение кинетики кристаллизационных процессов, постановки экспериментов, подтверждающих или опровергающих существующие гипотезы о кинетике кристаллизации, а также изучение взаимодействия белков друг с другом.

На данный момент времени отсутствует теория, дающая количественную оценку, описывающая кристаллизационные процессы в динамике, которая позволяла бы рассчитывать необходимые соотношения параметров для возникновения зародышей кристаллов как мембранных, так и не мембранных белков.

Глава 3 Материалы и методы Приготовление образцов 3.1 В рамках данной работы была приготовлена серия концентраций апоферритина в тяжёлой воде, использованная для измерений на установках МУР. Также были приготовлены липидные фазы для поиска тех липидов, которые образуют кубические фазы. Процесс приготовления описан ниже.

3.1.1 Серия концентраций апоферритина

Изначально апоферритин был заказан у фирмы Sigma Aldrich (каталожный номер A3660). Данный раствор содержал глицерин, поэтому буфер был заменён на тяжёлую воду с помощью центрифугирования (6000 rpm) в центриконах на 33 кДа. При этом концентрация глицерина в растворе уменьшилась более чем в 100 раз, так что в дальнейшем она считалась равной нулю.

После замены буфера раствор был сконцентрирован до максимума (28,3 мг/мл).

Затем, методом титрования была приготовлена серия концентраций апоферритина в тяжёлой воде.

Итоговые концентрации были измерены на приборе Nanodrop 2000c, со следующими параметрами измерения:

Коэффициент экстинкции для апоферритина на длине волны 280 взят равным

1.02 л/гр см. [31] Lid factor: 50 – для концентраций выше 7 мг/мл, 10 – для низких концентраций.

После приготовления концентрации немного отличались от предполагаемых изначально. Итоговая серия концентраций апоферритина в тяжёлой воде получилась, как показано в Табл. 1.

Табл. 1. Предполагаемая и реальная серии концентраций апоферритина.

Тяжёлая вода использована для уменьшения некогерентной составляющей фонового рассеяния нейтронов для метода МУРН. Для метода МУРР нет разницы между использованием тяжёлой воды и обычной, так как рентгеновское излучение чувствительно только к электронной плотности вещества, а излучение нейтронов чувствительно к ядерной плотности.

3.1.2 Липидные фазы Липиды были синтезированы de-novo в лаборатории В.Г. Черезова в The Scripps Research Institute. Список липидов представлен в Табл. 2.

Для каждого отдельного липида были приготовлены растворы:

HEPES 25 ммоль pH 7.0 Липид Компоненты смешаны в отношении 3:2 v/v с помощью шприцевого миксера (см.

Рис. 14). Точность определялась шкалой на шприцах и составила порядка 10%.

Липидные фазы были помещены в капилляры, а те, в свою очередь, запаяны с помощью газовой горелки и воска. Затем капилляры закреплены на держателях (см. Рис.

15).

Табл. 2. Список структурных формул липидов и их некоторых свойств.

Рис. 14. Шприцевой миксер и схема приготовления липидной кубической фазы [26] Рис. 15. Держатели для измерений методом МУРР. В капиллярах находятся липидные фазы. Справа на обеих фотографиях бегенат серебра и глассикарбон для калибровки и нормировки соответственно.

После того, как методом МУРР было определено какие именно липиды образуют липидные кубические фазы, потребовалось приготовить скрины – наборы растворов по 96 колодцев каждый, для определения более точных условий существования липидных кубических фаз. Было приготовлено 2 скрина – фирмы Hampton Research: «Salt Screen (HR2-245)» с добавлением PEG400, и фирмы Molecular Dimensions: «MemStart & MemSys HT-96 Crystallization Screen». Скрин «MemStart & MemSys HT-96 Crystallization Screen»

был использован в исходном виде без изменений.

Для липидов, образовавших липидные кубические фазы, а также для моноолеина – хорошо известного липида, взятого в качестве контрольного, были приготовлены следующие растворы:

HEPES 25mM pH 7.0 Липид Компоненты смешаны в отношении 2:3 v/v с помощью миксера. Точность также определялась шкалой на шприцах и составила порядка 10%.

Далее, липидная кубическая фаза в шприце помещалась в кристаллизационный робот, который раскапывал её на кристаллизационную плашку, а сверху раскапывал растворы из скрина так, что капли растворов покрывали липидные кубические фазы.

Фотография робота в процессе приготовления липидной кубической фазы представлена на Рис. 16.

Рис. 16. Процесс приготовления липидной кубической фазы кристаллизационным роботом на кристаллизационной плашке. [32]

Параметры раскапывания:

–  –  –

Далее, плашка накрывалась сверху плёнкой из COC (англ. – cyclo-olefin-copolymer)

– материал, который хорошо пропускает рентгеновское излучение, в отличие от обычного стекла.

После этого, кристаллизационная плашка измерялась на установке Ригаку, МФТИ методом МУРР.

Методы исследования липидов и белков 3.2 Методы, которые применялись в данной работе для определения липидных фаз и для изучения апоферритина – это методы малоуглового рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей.

3.2.1 Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей Метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУРР) – это дифракционный метод исследования пространственной структуры вещества при упругом рассеянии под малыми углами рентгеновского излучения на частицах, размеры которых лежат в нанометровом диапазоне.

Метод находит широкое применение для получения информации о форме и строении огромного числа материалов: белковых молекул, поверхностно-активных веществ, различных дисперсных систем (например, пигментов в краске, клеток крови), эмульсий, волокон, катализаторов, полимеров и нанокомпозитов, жидких кристаллов. [33, 34] Ниже представлено изложение физических основ, на которых базируется метод МУРР.

Рассеяние плоской монохроматической волны 3.2.1.1 Рассмотрим падающую плоскую монохроматическую волну на рассеивающий центр, который под действием излучения, становится источником сферической волны (см.

Рис. 17).

–  –  –

Амплитуда рассеянной сферической волны равна произведению амплитуды падающей волны и коэффициента | |, где значение определяется видом падающего излучения и природой рассеивающего центра, находящегося в точке. Чем сильнее взаимодействие падающей волны с центром, тем больше коэффициент. Он имеет размерность длины и называется длиной рассеяния, или амплитудой рассеяния точечного центра.

Рассмотрим теперь рассеяние плоской монохроматической волной на реальных объектах, состоящих из совокупности ядер и электронов, которые можно рассматривать как точечные рассеивающие центры (см. Рис. 18).

Рис. 18. Схематическое изображение рассеяния плоской волны на реальном объекте.

Рассеивающую способность произвольного скопления ядер, электронов при облучении их рентгеновскими лучами можно характеризовать рассеивающей плотностью ( ) – скалярным полем, заданным в ограниченной области пространства. В случае рентгеновского рассеяния ( ) – плотность распределения заряда.

Взаимодействие волны с веществом можно представить как взаимодействие волны со всеми ядрами и электронами, которые становятся источниками сферических волн.

Суперпозиция этих волн представляет собой первое приближение к реальному рассеянию.

Рассеянная волна, в свою очередь, рассеивается на всех центрах, давая совместно с первичным рассеянием, второе приближение и. т. д. При не очень сильном взаимодействии первичной волны с отдельными центрами последовательные приближения рассмотренного типа сходятся к некоторой результирующей волне. Но вычисления этих приближений обычно очень громоздки, поэтому мы ограничимся рассмотрением первого приближения.

Расчёт рассеянной волны основан на теории возмущений.

Волна ( ), рассеянная полем ( ) получается из решения волнового уравнения (3.2):

( )] ( ) [

–  –  –

Решение этого уравнения ищут в виде степенного ряда по. Свободный член этого ряда – это просто падающая волна, а первый член – соответственно первое приближение к рассеянной волне.

В случае, когда можно ограничиться первым приближением, амплитуда в точке будет состоять из двух слагаемых [35] (3.3):

| | ( )( ( )( ) ) () | |

–  –  –

Выражение (3.5) представляет собой интеграл Фурье, т.е. разложение функции ( ) по базисной системе ортогональных функций.

Решением обратной задачи будет (3.6):

() () Экспериментально определяется не сама амплитуда рассеяния, а только поток рассеянной энергии, или поток частиц, пропорциональный квадрату амплитуды рассеяния (3.7):

() | ( )| ()

– телесный угол). Функция ( ) – называется интенсивностью рассеяния и имеет ( размерность квадрат длины. Важной характеристикой объекта является полная интенсивность, которая получается интегрированием (3.7) по всем углам (3.8):

() Основной задачей структурного анализа является восстановления распределения рассеивающей плотности ( ) по измеренной функции ( ) Основным математическим аппаратом для этого служит теория преобразований Фурье.

Преобразование Фурье. Свёртка функций 3.2.1.2 Для дальнейшего построения теории потребуется математический аппарат преобразований Фурье и свёрток функций.

Преобразованием Фурье функции ( ) называется (3.9):

() [ ( )] ()

Также есть обратное преобразование Фурье, которое имеет вид (3.10):

() [ ( )] ()

–  –  –

Наиболее важным приложением понятия свёртки в теории дифракции является запись с её помощью явного выражения для интенсивности рассеяния.

Действительно, если сделать обращение Фурье функции ( ), то получим (3.14):

() [| ( )| ] [ ( ) ( )] () ( ) ()( )

–  –  –

() () Т.е. интенсивность рассеяния и автокорреляционная функция – такие же трансформанты Фурье, как амплитуда рассеяния и рассеивающая плотность.

Использование свойств преобразований Фурье позволяет записать важное соотношение для полной энергии рассеяния.

По теореме Парсеваля (3.17):

() ()

–  –  –

Соотношение (3.16) необходимо для получения корреляционной функции в явном виде.

Для этого перепишем (3.16) для интенсивности рассеяния фиксированной частицей (3.18):

() () ( )

–  –  –

() () () ( ) () ( )

–  –  –

() () ( ) ( ( ))

Из (3.19) получим формулу (3.21):

() () ()

–  –  –

() () () ( )

Преобразование, обратное к (3.22), запишем в виде (3.23):

() () () Соотношения (3.21 – 3.23) имеют огромное значение при анализе малоугловых данных. Корреляционная функция, которая может быть рассчитана из малоугловой кривой, позволяет сразу же сделать ряд заключений о строении частицы. В частности, из (3.22) следует, что при, где – максимальный размер частицы. Тогда () (3.21) перепишем в виде (3.24):

() () ()

–  –  –

Интенсивность рассеяния для простых геометрических тел 3.2.1.4 Для примера, рассчитаем интенсивности рассеяния для простых геометрических тел. Рассмотрим некоторые характерные типы объектов рассеяния и вычислим для них амплитуды рассеяния и соответствующие интенсивности.

Прямоугольный параллелепипед

–  –  –

|| ( ) { ||

–  –  –

( )) ( ( ) () ( ) Положим и посмотрим на вид функций, полученных для амплитуды и интенсивности малоуглового рассеяния.

–  –  –

Зная амплитуду рассеяния, легко вычислить интенсивность ( ):

( )) ( ( ) () ( )

–  –  –

() ( ) ( ( ) ) ( )) ( )) ( ( ) ( ( )

–  –  –

( )) ( )) ( ( ) ( ( ) () | ( )| ( )

–  –  –

( ( )) ()

–  –  –

() () () ( ) [ () ( )] ( ) ( )] [ ()

–  –  –

Поэтому (3.25) можно переписать в виде (3.26):

( ) ( ) () () ( ) ()

–  –  –

Этот закон убывания при больших углах рассеяния имеет довольно общий характер и находит широкое применение.[33]

Важнейшей интегральной характеристикой является инвариант Порода (3.28):

() Из (3.28) следует, что пропорционален полной энергии рассеяния. Инвариант Порода применяется при расчёте целого ряда структурных параметров. В частном случае однородной частицы, он непосредственно связан с её объёмом:.

–  –  –

() ()

А радиус гирации определится следующим образом (3.32):

() ( ) Таким образом, по начальной части кривой вне зависимости от конкретного строения частицы можно определить два параметра – ( ), характеризующий общее количество рассеивающей материи, и, который несёт информацию, о распределении рассеивающей материи относительно центра масс частицы.

Заметим, что в (3.29) разложение представляет собой первые два члена ряда ) при малых.

Логарифмируя (3.29), имеем (3.33):

() ( [ ( )] [ ( )]

–  –  –

Аналогично получаются приближения Кратке (3.34):

[ ( )] [ ( )] для сильно вытянутых частиц. И (3.35):

[ ( )] [ ( )] для сильно сплюснутых частиц.

Из наклона соответствующих прямых можно найти характерные размеры частиц.

Для случая сильно вытянутых частиц – характерная длина частицы.

–  –  –

3.2.2 Малоугловое рассеяние нейтронов Механизм нейтронного рассеяния на атомах вещества существенно отличается от механизма рентгеновского рассеяния. Для нейтронов эквивалентная длина волны де

Бройля определяется из соотношения (3.38):

Где – масса нейтрона и его скорость соответственно, – постоянная Планка.

Если на выходе из нейтронного реактора поток нейтронов проходит через замедлитель с температурой, то средний квадрат скорости нейтронов удовлетворяет соотношению (3.39):

–  –  –

Рассеяние нейтронов происходит в основном на атомном ядре. Рассмотрим ядро с ненулевым спином, на которое падает плоская волна нейтронов. Тогда рассеяние определяется общей формулой (3.1), причём величина определяется характером взаимодействия нейтрона с ядром. В работах [36, 37] рассмотрены детали таких взаимодействий.

Упругое рассеяние нейтронов может иметь как потенциальный характер, так и быть связано с резонансным поглощением.

В случае единственного резонансного уровня длина нейтронного рассеяния определяется формулой Брейта и Вигнера (3.41):

( ) () () ( ) ( )

–  –  –

– ширина резонансного уровня соответственно для излучения с той же энергией и для его поглощения.

Вдали от резонанса (3.41) переходит в (3.42):

Для интегрального поперечного сечения нейтронов формула более простая, чем в случае рентгеновского излучения, и имеет вид (3.43):

Так как нейтронное упругое рассеяние изотропно и не зависит от угла рассеяния из-за малых размеров ядра. Данные формулы получены в предположении закреплённых в начале координат ядер, что является хорошим приближением для случая твёрдых тел.

Методы исследования взаимодействия белков 3.3 Данные, полученные с установок МУР, позволяют не только изучать структуру и форму белков, но также понять некоторые аспекты взаимодействия этих белков в растворе друг с другом. Для изучения взаимодействия используется алгоритм, описанный ниже.

Для начала, запишем интенсивность в зависимости от значения модуля вектора рассеяния в виде (3.44):

() | ( )| ( ) Где ( ) – это амплитуда малоуглового рассеяния, или так называемый формфактор, ( ) – структурный фактор, а – концентрация белка в растворе.

Структурный фактор – это функция, отвечающая за пространственное распределение молекул белка, или, другими словами, показывает взаимодействие между белками.

Методом Орнштейна-Цернике, подробно описанным в книге Свергуна Д.И. [35], вычисляется кривая интенсивности, включающая в себя только форм-фактор, но не включающая структурного фактора. Далее, исходная кривая МУР делится на кривую, не включающую структурного фактора. Получаем кривую структурного фактора, исследование поведения которой позволяет делать выводы о наличии/отсутствии взаимодействия молекул белков в растворах.

Схематическое изображение кривой структурного фактора представлено на Рис.

23, а в работе [38] отражены основные свойства структурного фактора и представлены пути анализа взаимодействий частиц на основании поведения кривых МУР.

Рис. 23. Схематическое изображение структурного фактора S(q). [38] Основным методом исследования взаимодействий является метод ОрнштейнаЦернике. Суть метода заключается в том, что проанализировав серию концентраций одних и тех же частиц можно сделать вывод об изотермической сжимаемости раствора – очень важный параметр, служащий для понимания процессов взаимодействия частиц.

–  –  –

На Рис. 24 показана теоретическая кривая, соответствующая нулевой концентрации частиц в растворе. Если восстановить её в осях, то получится кривая МУР, не содержащая структурного фактора. С её помощью, просто разделив исходные кривые МУР на полученную кривую, получаются кривые структурного фактора. Их анализ и позволяет делать вывод о характере взаимодействия белков в растворе.

–  –  –

Глава 4 Результаты Кривые малоуглового рассеяния 4.1 В данной работе на трёх различных установках МУР (BM-29 ESRF, Grenoble, France; ЮМО ИБР-2, ОИЯИ, Дубна, Россия; Ригаку, МФТИ, Долгопрудный, Россия) была измерена серия концентраций апоферритина в тяжёлой воде.

4.1.1 Данные с синхротрона ESRF

–  –  –

Далее, каждый образец помещался в капилляр d = 1.8 mm и подвергался рентгеновскому излучению.

Технические характеристики пучка BM-29:

Рабочий диапазон энергий BM29 от 7 до 15 кЭв. Пучок изгибается под действием магнитного поля, а усиление потока на детекторе достигается благодаря двойному многослойному монохроматору (ширина энергетической щели ~ 10-2 Эв) и 4 мрад тороидальным зеркалом длиной 1.1 м.

Экспериментальная камера оборудована мраморным столом, на котором расположены 2D детектор, робот для смены образцов и соединяющая труба. Достижимый диапазон по q 0.01 - 5, что достаточно для определения (радиуса гирации) исследуемой частицы размером 20 нм. Сбор данных, их обработка и анализ произведены в автоматическом режиме благодаря специальному программному обеспечению BsxCuBE.

Фотография экспериментальной установки представлена на Рис. 25. Более подробное описание установки представлено на сайте ESRF [39].

Рис. 25. Экспериментальная установка: мраморный стол, на котором расположены 2D детектор; робот для смены образцов и соединяющая труба. [39] Образец помещался в капилляр и подвергался рентгеновскому излучению в виде 10 импульсов длиной по 2 секунды каждый. Кривая малоуглового рассеяния снималась с 2D детектора. Затем из неё был вычтен фон. После сбора данных все 10 кривых (с уже вычтенным фоном) усреднены. На выходе получены кривые рассеяния только от белка апоферритин (см. Рис. 26).

–  –  –

Калибровка производилась с помощью бегената серебра, предварительно помещённого в капилляр (см. Рис. 27).

Рис. 27. Капилляр с бегенатом серебра для установки BM-29 ESRF.

4.1.2 Данные с реактора ИБР-2 ОИЯИ Также был проведён эксперимент на ЮМО ИБР-2, ОИЯИ. ИБР-2 со своими уникальными техническими решениями имеет один из самых высоких потоков нейтронов у замедлителя в мире: ~1016 н/см2/с с 1850 МВт пиковой мощности. Несмотря на это, реактор экологически выгоден: он потребляет гораздо меньше энергии, чем другие исследовательские реакторы и использует очень мало топлива (меньше чем 20 л) которое служит около 15-20 лет. [40]

Принципиальная схема работы установки показана на Рис. 28.

Рис. 28. Схема установки ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ. 1 – two reflectors; 2 – zone of reactor with moderator; 3 – chopper; 4 – first collimator; 5 – vacuum tube; 6 – second collimator; 7 – thermostate; 8 – samples table; 9 – goniometer; 10-11 – Vn-standard; 12 – ring-wire detector;

13 – position-sensitve detector "Volga"; 14 – direct beam detector. [41] Для той же самой серии концентраций апоферритина (0.68, 1.5, 3.3, 7.0, 16.1, 23.2,

28.3 мг/мл) был проведён эксперимент и получены кривые малоуглового рассеяния методом МУРН.

Данные обработаны с помощью программы SAS. Данные МУРН представлены на Рис. 29.

–  –  –

4.1.3 Данные с дифрактометра Ригаку МФТИ Последний из серии экспериментов был проведён на установке МУРР – дифрактометре Ригаку, МФТИ. Установка Ригаку – это установка МУРР. Источником рентгеновского излучения служит вращающийся медный анод. Длина волны. Далее, пучок проходит через коллиматор и попадает на образец, находящийся в вакуумной камере. Рентгеновское излучение фиксируется ПЧД детектором.

Принципиальная схема установки представлена на Рис. 30.

–  –  –

Данные МУРР обрабатываются программным пакетом ATSAS. Полученные экспериментальные данные для той же серии концентраций апоферритина (0.68, 1.5, 3.3, 7.0, 16.1, 23.2, 28.3 мг/мл) представлены на Рис. 31.

Рис. 31. Кривые I(q) для серии концентраций апоферритина, полученные методом МУРР на дифрактометре Ригаку, МФТИ.

Анализ данных малоуглового рассеяния 4.2 Данные, полученные для одних и тех же образцов на трёх различных установках МУР, являются уникальными в плане того, что позволяют, во-первых, провести сравнительный анализ двух методов – МУРР и МУРН, а во-вторых, сравнить характеристики трёх различных установок МУР.

Также стоит отметить возможность собрать огромную статистику и с хорошей точностью вычислить интегральные параметры и характерные размеры белка.

4.2.1. Сравнение данных с различных установок Интегральные параметры и характерные размеры, полученные при изучении серии концентраций апоферритина представлены в Табл. 3.

Результаты из Табл. 3 были подвергнуты дополнительному анализу. При рассмотрении данных, полученных на установке ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ, принимались во внимание следующий концентрации: 3.33, 7.0, 16.1, 23.2 (буфер – исходный, содержащий глицерин), 28.3 мг/мл. Величины I(0) (интенсивность МУР при нулевом значении модуля вектора рассеяния) и V (рассеивающий рентгеновское излучение объём одной молекулы апоферритина) были получены с помощью программы Mathematica. Концентрации вычислены с помощью спектрофотометра Nanodrop 2000с, полагая коэффициент экстинкции для апоферритина равным = 1.02 л/гр см [31].

С помощью программы Mathematica, зная I(0), V, n (концентрация апоферритина), были найдены (разность рассеивающих плотностей апоферритина и тяжёлой воды) и (средние значения для внутреннего, внешнего радиусов, а также радиуса гирации) (см. Табл. 4).

Значение, полученное при анализе малоугловых данных, полученных на установке ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ, оказалось одинаковым для всех концентраций и равным. Точность вычисления оказалась близка к точности ( ) измерения концентраций на спектрофотометре Nanodrop.

Табл. 3. Интегральные параметры апоферритина, вычисленные с учётом структурного фактора с помощью программы Mathematica.

Табл. 4. Усреднённые интегральные параметры апоферритина. Для установки Ригаку, МФТИ данные получены в относительных единицах, поэтому геометрические размеры белка не определены.

При сравнении среднего радиуса гирации для апоферритина из данных, приведённых в Табл. 4 следует, что значения для установки МУРН ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ оказались ниже на 2, чем для двух других установок МУРР.

Это может говорить о том, что метод МУРН, в отличие от метода МУРР, поразному учитывает окружение прилежащего водного слоя у поверхности молекулы белка.

4.2.2. Структурный фактор и анализ взаимодействия белков в растворе Вычислен структурный фактор для трёх серий экспериментальных данных с использованием метода, описанного в параграфе 3.3. Графики теоретических кривых, соответствующие нулевым концентрациям апоферритина представлены на Рис. 32.

Графики структурных факторов представлены на Рис. 33.

–  –  –

Рис. 33. Кривые структурных факторов ( ) для серий концентраций апоферритина, полученные при анализе данных с установок: A – Ригаку, МФТИ; Б – ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ; В – BM-29, ESRF.

Проанализировано поведение кривых структурного фактора, и построена аппроксимация пиков для кривых, соответствующих нескольким высоким концентрациям.

Аппроксимация проведена гауссовыми пиками, с учётом возможности наложения двух гауссовых пиков друг на друга. Это может быть обусловлено физическим смыслом первого пика кривой ( ) – который отвечает за характерное расстояние между частицами в растворе. Тогда, второй пик, находящийся на расстоянии, где – это координата центра первого пика, может обозначать двойное характерное расстояние между частицами, но быть с меньшей интенсивностью, так как взаимодействие частиц, находящихся на расстоянии вдвое больше характерного будет слабее, чем между частицами, находящимися рядом друг с другом.

Так, например, для кривых ( ), полученных при анализе данных с установки Ригаку, МФТИ, (см. Рис. 33.А), аппроксимация пиков построена для концентраций 7.0, 16.1, 23.2, 28.3 мг/мл. Пики аппроксимированы в программе Origin. Графики с аппроксимациями представлены на Рис. 34.

Рис. 34. Аппроксимация структурных факторов ( ) для некоторых концентраций апоферритина из эксперимента, проведённого на установке Ригаку, МФТИ: A – 28.3 мг/мл; Б – 23.2 мг/мл; В – 16.1 мг/мл; Г – 7.0 мг/мл.

Для кривых ( ), полученных при анализе данных с установки ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ, (см. Рис. 33.Б), аппроксимация пиков построена для концентраций 7.0, 16.1, 28.3 мг/мл. Графики с аппроксимациями представлены на Рис. 35.

Рис. 35. Аппроксимация структурных факторов ( ) для некоторых концентраций апоферритина из эксперимента, проведённого на установке ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ: A –

28.3 мг/мл; Б – 16.1 мг/мл; В – 7.0 мг/мл;

Для кривых ( ), полученных при анализе данных с установки BM-29, ESRF, (см.

Рис. 33.В), аппроксимация пиков построена для концентраций 3.33, 7.0, 16.1, 23.2, 28.3 мг/мл. Графики с аппроксимациями представлены на Рис. 36.

Стоит отметить, что разрешающая способность установки МУР BM-29, ESRF позволила проанализировать структурный фактор для концентрации 3.33 мг/мл, что не удалось сделать для двух других установок МУР.

Рис. 36. Аппроксимация структурных факторов ( ) для некоторых концентраций апоферритина из эксперимента, проведённого на установке BM-29, ESRF: A – 28.3 мг/мл;

Б – 23.2 мг/мл; В – 16.1 мг/мл; Г – 7.0 мг/мл; Д – 3.33 мг/мл.

Проведён анализ максимумов для первых пиков структурных факторов. В частности было замечено смешение центра пика в зависимости от концентрации для всех трёх экспериментов (см. Рис. 37).

Рис. 37.

Изменение положений центров пиков структурных факторов ( ) для некоторых концентраций апоферритина из экспериментов, проведённых на установках:

A – BM-29, ESRF; Б – ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ; В – Ригаку, МФТИ.

Из физического смысла положения центра пика структурного фактора ()– величина, равная – характерное расстояние между молекулами белка. Зная характерные расстояния, был произведён пересчёт концентраций в предположении того, что все молекулы апоферритина в растворе находятся друг относительно друга на характерном расстоянии. Полученные концентрации не совпали с концентрациями начальными, а оказались больше их.

В связи с этим было сделано предположение о локальных увеличениях концентраций белков в растворе, то есть – кластеризация. Получились некоторые зависимости пересчитанных концентраций белка в кластерах от начальных концентраций в растворе. Данные зависимости были аппроксимированы прямой линией. Графики зависимостей пересчитанных концентраций от исходных представлены на Рис. 38.

Параметры аппроксимации представлены в Табл. 5.

Рис. 38. Зависимость концентраций апоферритина в кластерах от исходных концентраций. Эксперименты проведены на установках: A – BM-29, ESRF; Б – ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ; В – Ригаку, МФТИ.

–  –  –

Табл. 5. Параметры аппроксимации зависимостей концентраций апоферритина в кластерах от исходных концентраций в растворе.

Из данных, приведённых в Табл. 5 следует, что результаты для установки МУРН ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ снова несколько отличаются от установок МУРР. Для двух установок МУРР результаты хорошо согласуются друг с другом.

Измерение липидных фаз методом МУР 4.3 Метод МУРР нашёл ещё одно применение в данной работе. Это – определение фаз липидов (см. параграф 3.1.2). Для поиска липидов, образующих в избытке HEPES липидные кубические фазы в температурном диапазоне были измерены 12 липидов методом МУРР на установке Ригаку, МФТИ.

Параметры эксперимента:

–  –  –

• Температурный диапазон – (4 – 40 )

• Дальняя и ближняя камеры (Sc1 и Sc2)

• Время измерения образца – 30 мин Результаты эксперимента представлены в Табл. 6. Из результатов эксперимента следует, что 3 из 12 липидов образуют липидные кубические фазы в избытке HEPES. Это липиды № 4, 5, 11 (см. Табл. 2). Но липид №11 – это липид № 4, только с добавлением 10% холестерола. Поэтому, дальнейший анализ липидных кубических фаз проходил для двух липидов – № 4 и 5.

Развёрнутый анализ включал в себя проверку на образование липидных кубических фаз липидами № 4 и 5 в двух скринах «PEG400 Salt screen» и «MemStart & MemSys» (см.

параграф 3.1.2), а также вычисление параметра решётки на каждом шаге.

Программа, с помощью которой производилась обработка данных – SAXGUI.

Из расположения первых нескольких пиков можно легко определить фазу, которую образует липид. Далее, исходя из того, какая фаза образована, вычисляется параметр решётки. Подробный алгоритм описан в работе [42].

В качестве контроля использовался липид моноолеин. Были проведены серии экспериментов для каждого липида, в том числе и для моноолеина, и каждого скрина.

Одна серия экспериментов для липида № 5 и одного скрина состояла из исследования двух кристаллизационных плашек, отличавшихся порядком раскапывания: в прямом направлении – «Direct», и в обратном – «Reverse». Для липида № 4 было исследовано 4 плашки для «PEG400 Salt screen» и 2 плашки для «MemStart & MemSys».

Табл. 6. Данные МУРР для липидов в избытке HEPES в температурном диапазоне.

В начале, для контроля стабильности липидной фазы на больших временах была исследована динамика изменения параметра решётки моноолеина с «PEG400 Salt screen».

Результаты измерений представлены в Табл. 7. Параметры эксперимента:

Камера - Sc1 («дальняя камера») Время измерения для одного колодца – 45 сек.

Атмосферное давление Комнатная температура

–  –  –

На графиках в Табл. 7. Показаны зависимости параметра решётки ( ) от времени (ч). Симметрии решёток во всех колодцах для моноолеина – Pn3m.

Из данных, представленных в Табл. 7 следует, что параметр решётки меняется в пределах 10% с момента приготовления фаз, а при длительных промежутках времени выходит на константное значение.

Далее, эксперимент был поставлен для липида № 4 с «PEG400 Salt screen».

Результаты эксперимента представлены в Табл. 8.

–  –  –

В Табл. 9 – 12 показаны липидные фазы, и параметры решёток, установившиеся через 72 часа после приготовления для липида № 4 с «PEG400 Salt screen» для 4 различных кристаллизационных плашек.

Табл. 9. Итоговые фазы и параметры решётки для липида № 4 с «PEG400 Salt screen»

через 72 часа после приготовления (плашка № 1).

Из данных в Табл. 9 следует, что в основном происходит установление значения параметра решётки со временем, хотя для некоторых колодцев данный эффект не наблюдается из-за недостаточной чистоты эксперимента.

Табл. 10. Итоговые фазы и параметры решётки для липида № 4 с «PEG400 Salt screen»

через 72 часа после приготовления (плашка № 2).

Табл. 11. Итоговые фазы и параметры решётки для липида № 4 с «PEG400 Salt screen»

через 72 часа после приготовления (плашка № 3).

Табл. 12. Итоговые фазы и параметры решётки для липида № 4 с «PEG400 Salt screen»

через 72 часа после приготовления (плашка № 4).

Из Табл. 9 – 12 видно, что в некоторых колодцах наблюдается нестабильность фазы даже через 72 часа после приготовления (A5, B6, H8, G10, H1, H10), а в колодце G6 всегда наблюдается фаза Ia3d. В остальных же колодцах – стабильно Pn3m.

Результаты экспериментов с липидом № 4 с «MemStart & MemSys» скрином, а также с липидом № 5 с «MemStart & MemSys» и «PEG400 Salt screen» представлены в Табл. 13 – 17. Динамика изменения параметра решётки для липида № 5 для плашки с порядком раскапывания «Direct» представлена на Табл. 18.

Табл. 13. Итоговые фазы и параметры решётки для липида № 4 с «MemStart & MemSys»

через 72 часа после приготовления (плашка «Direct»).

Табл. 14. Итоговые фазы и параметры решётки для липида № 4 с «MemStart & MemSys»

через 72 часа после приготовления (плашка «Reverse»).

Табл. 15. Итоговые фазы и параметры решётки для липида № 5 с «PEG400 Salt screen»

через 72 часа после приготовления (плашка «Direct»).

Табл. 16. Итоговые фазы и параметры решётки для липида № 5 с «MemStart & MemSys»

через 72 часа после приготовления (плашка «Direct»).

Табл. 17. Итоговые фазы и параметры решётки для липида № 5 с «MemStart & MemSys»

через 72 часа после приготовления (плашка «Reverse»).

–  –  –

Из анализа данных Табл. 13 – 17 получены результаты для параметров решётки, а также их симметрий (см Рис. 39 и Рис. 40).

Рис. 39. Липидные фазы и средние параметры решёток для липида № 4.

Рис. 40. Липидные фазы и средние параметры решёток для липида № 5.

Из результатов, приведённых на Рис. 39 и Рис. 40 следует, что липид № 4 образовал липидные кубические фазы во всех (96/96) колодцах в «PEG400 Salt screen»

(95/96 – Pn3m; 1/96 – Ia3d), и в 92/96 колодцах в «MemStart & MemSys» (58/92 – Pn3m;

34/92 – Ia3d). Липид № 5 несколько хуже образовывает липидные кубические фазы в данных скринах – 74/96 колодца в «PEG400 Salt screen» (73/74 – Pn3m; 1/74 – Ia3d); и 56/96 колодцев в «MemStart & MemSys» (42/56 – Pn3m; 14/56 – Ia3d).

Все липидные кубические фазы оказались стабильны на больших временах ( 72 часов), что позволяет говорить о возможности для кристаллизации белков в данных липидных кубических фазах. Однако параметр решётки, образованной такими липидами недостаточно большой для использования данных липидов в качестве условий для кристаллизации крупных белковых комплексов, но для решения некоторых специфических задач они вполне могут быть использованы.

Глава 5

Заключение Из анализа поведения кривой для структурного фактора для серии концентраций апоферритина можно сделать выводы о наличии в водном растворе белков некоего ближнего порядка, соответствующего более высоким концентрациям, нежели исходные (для метода МУРР концентрации отличаются приблизительно в 2 раза, для МУРН – в 2.7 раз).

Таким образом, возникает предположение о кластеризации белков апоферритина в водном растворе. Вопрос о причинах возникновения кластеризации остаётся открытым и требует дальнейших исследований.

Так, например, заниженные на 2 значения, для метода МУРН по сравнению с МУРР, говорят о том, что нейтроны чувствительны к водному слою, толщиной примерно в одну молекулу воды, прилегающему непосредственно к молекуле белка.

По результатам, полученным на установках МУР можно судить о разрешающей способности данных установок, ширине диапазона для модуля вектора рассеяния, а также об их пропускной способности.

Если учесть параметры, указанные выше, можно сделать вывод о том, что проведение экспериментов на установке Ригаку, МФТИ целесообразно, если задачи не требуют очень широкого диапазона по модулю вектора рассеяния и спокойно решаются в диапазоне от 0.006 до 0.17 [1/ ].

Задача для определения липидных фаз – это как раз та задача, которую очень эффективно решает установка МУР Ригаку, МФТИ.

Однако задачи по расшифровке белковых структур требуют гораздо большего разрешения и гораздо большей точности установки, поэтому для таких задач целесообразно использования установки BM-29, ESRF.

На установке МУРН ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ целесообразно решать задачи по исследованию структур, включающих в себя белок и липид, так как возможно проведение вариации контраста при использовании метода нейтронного рассеяния. Однако, данная установка неплохо справляется и с задачами по расшифровке белковых структур, хотя время измерения, необходимое для набора приемлемой статистики на этой установке на порядок больше, чем на BM-29, ESRF.

Анализ результатов для кривых МУРР липидных кубических фаз, полученных на установке Ригаку, МФТИ, показал стабильность липидных кубических фаз на временах порядка нескольких суток, и, фактически, пригодность материально-технической базы для проведения качественных экспериментов по кристаллизации.

Однако, параметры решётки для получившихся липидных кубических фаз недостаточно велики для решения задач по кристаллизации крупных белковых комплексов, таких как АТФ-синтетаза и т.д., так что поиск походящих липидов и условий для достижения поставленной цели продолжается.

Для настоящего исследования все поставленные задачи выполнены в рамках проделанной работы. Полученные результаты послужат основанием для выполнения дальнейших экспериментов в контексте глобальной задачи по проникновению в суть структурной и функциональной организации мембранных белков, взаимодействия мембранных белков и липидов в мембранах.

Основные результаты данной работы представлены в публикациях [43 - 48].

–  –  –

Анализ результатов данной работы позволяет сделать следующие выводы по каждому из аспектов проведённого исследования:

Проведен сравнительный анализ данных серии концентраций апоферритина, полученных на установках Ригаку, МФТИ и BM-29, ESRF, и на нейтронном спектрометре ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ. Получены интегральные характеристики структуры белка ( ( ) ). Обнаружено совпадение параметров в пределах экспериментальных ошибок для рентгеновских установок и небольшое различие для нейтронного спектрометра.

Сделаны выводы о наличии в водном растворе белков ближнего порядка, соответствующего более высоким концентрациям, нежели исходные (для метода МУРР концентрации отличаются приблизительно в 2 раза, для МУРН – в 2.7 раз).

Сделано предположение о том, что в методах МУРР и МУРН по-разному учитывается окружение белка. Нейтронное рассеяние чувствительно к водному слою, толщиной примерно в одну молекулу воды, прилегающему непосредственно к молекуле белка.

Показано, что в широком диапазоне концентраций для белка апоферритина существует ближний порядок, соответствующий кластеризации в водном растворе.

Замечено, что липид № 4 хорошо образует липидные кубические фазы в скринах «PEG400 Salt screen» и «MemStart & MemSys», тогда как липид № 5 более склонен к образованию ламеллярных фаз в данных скринах, особенно в «MemStart & MemSys».

Доказана стабильность липидных кубических фаз для липидов № 4, 5 в течение нескольких суток, следовательно, данные липиды могут быть использованы для кристаллизации белков.

Обнаружено, что параметры решётки для получившихся липидных кубических фаз недостаточно велики для решения задач по кристаллизации крупных белковых комплексов, таких как АТФ-синтетаза и т.д.

Благодарности5.2

Автор работы выражает благодарности научному руководителю – к.ф.-м.н.

Куклину А.И. за помощь в каждом аспекте проделанной работы, связанной с апоферритином и малоугловым рассеянием. Также, к.ф.-м.н. Борщевскому В.И. за грамотное руководство и организацию рабочего процесса, Синцову Михаилу – за помощь в каждом аспекте работы, связанной с приготовлением образцов с липидами и с обработкой данных МУРР для липидных фаз. А также: Мишину Алексею, Зиновьеву Егору, Рижикову Юрию, и всем, кто помогал в этом нелёгком деле.

Литература

1. Filmore D. It's a GPCR world //Modern drug discovery. – 2004. – Т. 7. – С. 24-28.

2. Landau E. M., Rosenbusch J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins //Proceedings of the National Academy of Sciences.

– 1996. – Т. 93. – №. 25. – С. 14532-14535.

3. Kuklin A. I. et al. Comparative study on low resolution structures of apoferritin via SANS and SAXS //Journal of Physics: Conference Series. – IOP Publishing, 2012. – Т.

351. – №. 1. – С. 012009.

4. Fan K., Gao L., Yan X. Human ferritin for tumor detection and therapy //Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. – 2013. – Т. 5. – №.

4. – С. 287-298.

5. Кишкун А.А. Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции: руководство для врачей. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 976 с.

6. Kanekiyo M. et al. Self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizing H1N1 antibodies //Nature. – 2013. – Т. 499. – №. 7456. – С. 102-106.

7. Малая медицинская энциклопедия. — М.: Медицинская энциклопедия. 1991—96 гг.

8. Первая медицинская помощь. — М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г.

9. Энциклопедический словарь медицинских терминов. — М.: Советская энциклопедия. — 1982—1984 гг.

10. Theil E. C. Ferritin: at the crossroads of iron and oxygen metabolism //The Journal of nutrition. – 2003. – Т. 133. – №. 5. – С. 1549S-1553S.

11. Laufberger, M., Bull. sot. chim. biol., 19, 1575 (1937).

12. Granick S. Ferritin IV. Occurrence and immunological properties of ferritin //Journal of Biological Chemistry. – 1943. – Т. 149. – №. 1. – С. 157-167.

13. Andrews S. C. Iron storage in bacteria //Advances in microbial physiology. – 1998. – Т.

40. – С. 281-351.

14. Crichton R. R., Ward R. J. Iron homeostasis //Metal ions in biological systems. – 1998. – Т. 35. – С. 633.

15. Massover W. H. Ultrastructure of ferritin and apoferritin: a review //Micron. – 1993. – Т.

24. – №. 4. – С. 389-437.

16. Theil E. C. The ferritin family of iron storage proteins //Advances in enzymology and related areas of molecular biology. – 1993. – Т. 63. – С. 421-421.

17. Harrison P. M. The structure of apoferritin: molecular size, shape and symmetry from xray data //Journal of molecular biology. – 1963. – Т. 6. – №. 5. – С. 404-IN9.

18. Bryce C. F. A., Crichton R. R. The subunit structure of horse spleen apoferritin I. The molecular weight of the subunit //Journal of biological chemistry. – 1971. – Т. 246. – №.

13. – С. 4198-4205.

19. Precigoux G. et al. A crystallographic study of haem binding to ferritin //Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. – 1994. – Т. 50. – №. 5. – С.

739-743.

20. RCSB Protein Data Bank. URL:

http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1HRS (Дата обращения:

11.06.2014).

21. Macara I. G., Hoy T. G., Harrison P. M. The formation of ferritin from apoferritin.

Kinetics and mechanism of iron uptake //Biochem. J. – 1972. – Т. 126. – С. 151-162.

22. Macara I. G., Hoy T. G., Harrison P. M. The formation of ferritin from apoferritin.

Catalytic action of apoferritin //Biochem. J. – 1973. – Т. 135. – С. 343-348.

23. Kim M. et al. pH-Dependent structures of ferritin and apoferritin in solution:

Disassembly and reassembly //Biomacromolecules. – 2011. – Т. 12. – №. 5. – С. 1629Липиды // Большой энциклопедический словарь.

25. Липиды — статья из Большой советской энциклопедии (3-е издание). Л. Д.

Бергельсон.

26. Роснано. URL: http://thesaurus.rusnano.com/wiki/article1073 (Дата обращения:

29.06.2014).

27. Брагина Н.А., Миронов А.Ф., Мембранология, – М.: МИТХТ им. М. В.

Ломоносова, 2002. – 99 с.

28. Briggs J., Chung H., Caffrey M. The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system //Journal de Physique II. – 1996. – Т. 6. – №. 5. – С. 723-751.

29. Caffrey M., Cherezov V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases //Nature protocols. – 2009. – Т. 4. – №. 5. – С. 706-731.

30. Nollert P. et al. Molecular mechanism for the crystallization of bacteriorhodopsin in lipidic cubic phases //FEBS letters. – 2001. – Т. 504. – №. 3. – С. 179-186.

31. Han B. G. et al. Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals //Journal of structural biology. – 2012. – Т. 180. – №. 1.

– С. 249-253.

32. IBS – Institut de Biologie Structurale. URL: http://www.ibs.fr/platforms/other-facilitiesdevelopments/high-throughput-membrane-protein/?lang=en (Дата обращения:

23.06.2014).

33. Малоугловое рассеяние / Физическая энциклопедия / Гл. ред. А.М. Прохоров - М.:

Большая Российская энциклопедия. Т.3, 1992 – С. 41-44.

34. Суздалев И. П. Нанотехнология. Физико-химия нанокластеров, наноструктур и наноматериалов. КомКнига, 2006. – 592 с.

35. Свергун Д. И., Фейгин Л. А., Рентгеновское и малоугловое рассеяние, – М.: Наука, 1986. – 279 с.

36. Дж. Б. Дифракция нейтронов //М.: ИЛ. – 1957. – С. 233.

37. Нозик Ю. З., Озеров Р. П., Клаус Х. Структурная нейтронография. – Атомиздат, 1979.

38. Teixeira J. Introduction to small angle neutron scattering applied to colloidal science //Structure and Dynamics of Strongly Interacting Colloids and Supramolecular Aggregates in Solution. – Springer Netherlands, 1992. – С. 635-658.

39. ESRF – European Synchrotron Radiation Facility. URL:

http://www.esrf.eu/UsersAndScience/Experiments/MX/About_our_beamlines/BM29/Use rs/biosaxs-detectors/pilatus-1m (Дата обращения: 28.06.2014).

40. ОИЯИ – Объединённый институт ядерных исследований. URL:

http://flnp.jinr.ru/5/(Дата обращения: 28.06.2014).

41. ОИЯИ – Объединённый институт ядерных исследований. URL:

http://flnp.jinr.ru/135/(Дата обращения: 28.06.2014).

42. Joseph J. S. et al. Characterization of lipid matrices for membrane protein crystallization by high-throughput small angle X-ray scattering //Methods. – 2011. – Т. 55. – №. 4. – С.

342-349.

43. Е.В. Зиновьев, А.В. Власов, Ю.Л. Рижиков, В.А. Шевченко. Экспрессия, выделение и очистка белка бактериородопсина HmbRI_D94N // Труды 56-й научной конференции МФТИ, Общая и прикладная физика – 2013. – С. 39-40.

44. А.В. Власов, Е.В. Зиновьев, Т.Н. Муругова, Ю.Л. Рижиков,М.Ю. Синцов, А.И.

Куклин. Изучение вклада структурного фактора в кривую малоуглового рентгеновского рассеяния железосодержащего белка // Труды 56-й научной конференции МФТИ, Общая и прикладная физика – 2013. – С. 42-43.

45. Ю.Л. Рижиков, А.В. Власов, М.Ю. Синцов, А.В. Рогачев, Д.В. Соловьёв, А.И.

Куклин. Определение размера кристаллита и уровня микродеформаций бегената серебра на малоугловом рентгеновском спектрометре Ригаку // Труды 56-й научной конференции МФТИ, Общая и прикладная физика – 2013. – С. 47-48.

46. Alexey Vlasov, Tatiana Murugova, Sergey Grudinin, Oleksandr Ivankov, Dmytro Soloviov, Andrey Rogachev, Adam Round, Yury Ryzhykau, Alexey Mishin, Taras Balandin, Valentin Borschevskiy, Valentin Gordeliy, Alexander Kuklin. Protein structure and structural ordering versus concentration dependence.// Submitted to FEBS-EMBO 2014.

47. Ryzhykau Y.L., Soloviev D.V., Vlasov A.V., Round A., Kovalev Y.S., Ivankov A.I., Borschevski V.I., Gordeliy V.I., Kuklin A.I. Sructure factor analysis of small angle XRay and neutron scattering curves for apoferritin.// Submitted to International Conference «Condensed Matter Research at the IBR-2».

48. Vlasov A.V., Soloviev D.V., Round A., Ryzhykau Y.L., Kovalev Y.S., Ivankov A.I., Borschevski V.I., Gordeliy V.I., Kuklin A.I. Comparative analysis of small angle X-Ray and neutron scattering curves in absolute units.// Submitted to International Conference

Похожие работы:

«ТЕХНИЧЕСКИЙ КОДЕКС ТКП 45-5.03-20-2006 (02250) УСТАНОВИВШЕЙСЯ ПРАКТИКИ МОНОЛИТНЫЕ КАРКАСНЫЕ ЗДАНИЯ Правила возведения МАНАЛIТНЫЯ КАРКАСНЫЯ БУДЫНКI Правiлы ўзвядзення Издание официальное Министерство архитектуры и строительства Республики Беларусь Минск...»

«Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Омский государственный технический университет" Русский язык и культур...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК 2012 ТРУДЫ ИНСТИТУТА ОБЩЕЙ ФИЗИКИ им. А.М. ПРОХОРОВА Том 68 УДК 535.33/34+621.373.826 Е.В. СТЕПАНОВ ДИОДНАЯ ЛАЗЕРНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ И АНАЛИЗ ОРТОИ ПАРА-ИЗОМЕРОВ МОЛЕКУЛЫ H2O Ключевые слова: диодная лазерная спект...»

«"НТРОЛ| ТЕХНИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ И КАЧЕС1ВА ЦЕМЕНТИРОВАНИЯ СКВАЖИН !Г КАТАЛОГ ГЕОФИЗИКА Содержание АППАРАТУРА КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ЦЕМЕНТИРОВАНИЯ И ТЕХНИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ С К В А Ж И Н АМК-2000 5 СГДГ-100САМК-2000)...»

«ООО "АГ ИНЖИНИРИНГ" ® УСТРОЙСТВО ОХРАНЫ ПЕРИМЕТРОВ "БАГУЛЬНИК М" АВРТ.425689.001 ТУ ДАТЧИК РЕГИСТРАЦИИ ПРЕОДОЛЕНИЯ ЗАГРАЖДЕНИЙ "БАГУЛЬНИК М" Индекс: 2ДИ(ТГП) РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ АВРТ.426444.004-03 РЭ г. Мо...»

«ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ Г. Г. РАННЕВ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНЫЕ СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ Учебник Рекомендовано Учебно-методическим объединением по образованию в области приборостроения и оптотехники в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению "При...»

«ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ УРАВНЕНИЯ И dx ПРОЦЕССЫ УПРАВЛЕНИЯ N 1, 1997 dt Электронный журнал, рег. N П23275 от 07.03.97  http://www.neva.ru/journal e-mail: di@osipenko.stu.neva.ru ? Теория обыкновенных дифференциальных уравнений ИССЛЕ...»

«Электротехника и электроэнергетика 193 УДК 621.314.2 А.С. Плехов 1, М.Н. Охотников 2, В.Г. Титов 3 ТЕХНОЛОГИЯ ЭНЕРГОСБЕРЕЖЕНИЯ В ЭЛЕКТРОПРИВОДЕ ООО "Энергосбережение"1, ООО "Развитие"2, Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева 3 На примерах использования компенсацион...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородский государст...»

«Мусоропроводы жилых и общественных зданий и сооружений (взамен ВСН 8-72) СП 31-108-2002. Мусоропроводы жилых и общественных зданий и сооружений (взамен ВСН 8-72) Системанормативных документов в строительстве СВОДПРАВИЛ ПО ПРОЕКТИРОВАНИЮ И СТРОИТЕЛЬСТВУ МУСОР...»

«Социологические исследования, № 8, Август 2008, C. 106-115 МОТИВЫ СТУДЕНЧЕСКОЙ ЗАНЯТОСТИ Автор: М. А. ВОРОНА ВОРОНА Мария Александровна аспирант Саратовского государственного технического университета, ассистент кафедры Социальной а...»

«Техническая карта материала Издание: 05/08/2010; UA_10/2011_ AS Идентификационный № Sika® MonoTop® -910 N Sika® MonoTop® -910 N (старое название Sika® MonoTop®-610) Антикоррозионная защита арматуры и клеящий раствор Sika® MonoTop® -910 N одноком...»

«Всеволод Овчинников "Ветка сакуры" О содержании книги Всеволода Овчинникова Ветка сакуры позволяет судить ее подзаголовок Рассказ о том, что за люди японцы, а также названия разделов книги: Их вку...»

«ЧТО ТАКОЕ ИНТЕРНЕТ ЗАВИСИМОСТЬ? Компьютерная подневольность — не менее серьезное заболевание, чем алкоголизм, игромания или наркомания. Зависимость от компьютера и интернета провоцирует работу аналогичных механизмов, за исключением, пожалуй, только отсутствия такой физиологи...»

«· К вопросу о новеллах, введенных судебными уставами 1864 года В.Н. Тарасов 2) применение концепции стейкхолдерства в механизме реализации национально-государственного интереса. Последним элементом концепци...»

«УДК 330.101.541  ББК 65.012.2           М 55          Руководитель авторского коллектива и научный редактор  проф. О. П. Молчанова      Авторы:   Введение: Молчанова О. П.  § 1 – Солодов В. В.  § 2 – Кусов И. С.  § 3, § 6 – Царенко А. С.  § 4 – Молчанова О. П.  § 5 – Лившин А. Я.  § 7, § 10 – Батоврина Е. В.  § 8, § 11 – Логунцова И. В.    § 9 – Шест...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 540 519 C2 (51) МПК A61K 31/4365 (2006.01) A61K 47/38 (2006.01) A61K 47/26 (2006.01) A61K 47/12 (2006.01) A61K 47/04 (2006.01) A61K 9/48 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА A61P 7/02 (20...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт кибернетики Направление подготовки 09.04.03 Прикладная информатик...»

«Джемилев Керим Нильсович Расчеты упругих полей дислокационных петель и кристонов с целью идентификации центров зарождения мартенсита 01.04.07 Физика конденсированного состояния Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических...»

«Каталог решений по автоматизации • Зерноперерабатывающая промышленность;• Производство минеральных удобрений и туковых смесей;• Стекольная промышленность;• Производство сухих строительных смесей;• Производство бетона;• Металлургия и горнорудное производство.Зерноперерабатывающая промышленность: • автоматизация процессов транспортиро...»

«Двухполосные компонентные автомобильные акустические системы Prology EX-52c, EX-62c Руководство по эксплуатации. Руководство по эксплуатации определяет порядок установки и эксплуатации автомобильных акустических систем Prology EX-52с, EX-62с. Установка автомобильных акустических систем требует наличия у установщи...»

«ХАСАНШИН РУСТАМ НУРИСЛАМОВИЧ РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗОЛЯЦИИ ПОПУТНО ДОБЫВАЕМЫХ ВОД В СКВАЖИНАХ (НА ПРИМЕРЕ ТЕВЛИНСКО-РУССКИНСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ) Специальность 25.00.17 – "Разработка и эксплуатация нефтяных и г...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет име...»

«Борис Периль 1 Фестивальная практика: опыт CASE-STUDY Проведение больших и малых фестивалей исполнительских искусств в последние десять лет прочно вошло в повседневный обиход современной художественной жизни Российской Федерации, что актуализи...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.