WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 


«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «НИЖЕГОРОДСКИЙ ...»

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ

БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ им. Р.Е. АЛЕКСЕЕВА»

Кафедра «Нанотехнологии и биотехнологии»

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА РОСТ

БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ РОДА Saccharomyces Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Методологические основы исследований в биотехнологии»

для студентов, обучающихся по направлению 19.04.01 «Биотехнология» дневной формы обучения Нижний Новгород 2015 Составители: Т.Н. Соколова, О.В. Кузина, А.А. Калинина, В.Р. Карташов УДК 541.1 Влияние условий культивирования на рост биомассы дрожжей рода Saccharomyces: метод. указания к лабораторным работам по дисциплине «Методологические основы исследований в биотехнологии» для студентов, обучающихся по направлению 19.04.01 «Биотехнология» дневной формы обучения/ НГТУ; сост.: А.А. Калинина и др., Н. Новгород, 2015. – 40 с.

Лабораторный практикум включает выполнение студентамибиотехнологических процессов по ферментации и получению биологически активных веществ с использованием химических и микробиологических методов анализа.

Редактор Э.Б. Абросимова Подписано в печать 10.03.2013. Формат 60 841/16. Бумага газетная.

Печать офсетная. Усл. п. л. 0,5. Тираж 80 экз. Заказ.

Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева.

Типография НГТУ. 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24.

Нижегородский государственный технический университетим. Р.Е. Алексеева, 2015 Введение Получение многих биологически активных веществ в промышленном масштабе основывается на применении биотехнологических процессов. Таким образом получают антибиотики, белково-витаминные концентраты, некоторые гормоны, жиры и ненасыщенные жирные кислоты, аминокислоты и т.д. В основе этих производств лежат процессы ферментации.

К настоящему времени разработано несколько способов культивирования микроорганизмов: периодическое, непрерывное культивирование и культивирование иммобилизованных клеток.

Наиболее распространен способ периодического культивирования. При данном способе инокулят вносят в питательную среду, которая содержит заданное количество всех необходимых питательных веществ. При этом ни один из существенных компонентов питательной среды не поступает в систему в процессе культивирования, т.е. это закрытая система. Периодическое культивирование возможно, как поверхностным способом (на поверхности твердой питательной среды), так и глубинным способом (в жидкой питательной среде). При внесении микроорганизмов в питательную среду их рост прекращается тогда, когда содержание какого-нибудь из необходимых компонентов среды достигает минимума или в среде, накапливаются продукты метаболизма, ингибирующие рост микроорганизмов.

Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени, называется кривой роста. Типичная кривая роста имеет S-образную форму и характеризуется различными фазами, связанными с изменением состава питательной среды, составом биомассы и физиолого-биохимическими свойствами микроорганизмов.

Второй способ культивирования микроорганизмов – рост в непрерывной культуре. Все компоненты питательной среды постоянно поступают в систему и выводятся из нее. Это открытая система осуществляется только в глубинной культуре, чаще всего аэрируемой.





Третий – культивирование иммобилизованных клеток. Клетки микроорганизмов прикрепляются (иммобилизуются) на каких-либо инертных носителях. Питательная среда постоянно поступает в систему и выводится из нее, т.е. это тоже открытая система.

Для культивирования микроорганизмов необходимо наличие жизнеспособной посевной культуры (инокулята), питательной среды, содержащей все необходимые элементы питания (источники энергии, углерода, макро- и микроэлементов и, в случае потребности, факторы роста), отсутствие в среде разного рода ингибиторов роста. Необходимо также поддержание оптимальных для роста микроорганизмов физико-химических условий, окружающее среды (температура, рН, давление, условия аэрации, источники света и др.).

Лабораторная работа № 2

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ВЫРАЩИВАНИЯ НА РОСТ БИОМАССЫ

ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES

Теоретическая часть Расщепление органических субстратов необходимо микробной клетке для получения энергии, аккумулируемой в форме АТФ. Реакции, связанные с получением энергии – это реакции окисления, сопровождающиеся отнятием водорода от окисляемого субстрата. В зависимости от условий выращивания дрожжи рода Saccharomyces способны получать энергию для роста как за счет брожения, так и за счет дыхания. При брожениях отщепляемый от субстрата водород переносится на органические акцепторы, которые могут выделяться в среду.

В случае спиртового брожения, осуществляемого дрожжами в анаэробных условиях, глюкоза расщепляется на две триозы, конечными продуктами превращения которых являются углекислота и этанол. На молекулу глюкозы при брожении образуется 2 молекулы АТФ, используемые клеткой в анаболических процессах (рис. 1).

–  –  –

В аэробных условиях отщепляемый от окисляемого субстрата водород через дыхательную цепь переносится на кислород воздуха и конечными продуктами окисления глюкозы являются углекислота и вода:

С6Н12О6 + 6О2 6СО2 + 6 Н2О.

Выход АТФ в результате этой реакции составляет 38 молекул, т.е. в 19 раз больше, чем при сбраживании глюкозы. Большой выход энергии позволяет клетке осуществлять в аэробных условиях интенсивный синтез клеточного вещества. В анаэробных условиях для поддержания роста клетки должны метаболизировать значительно большее количество субстрата, поскольку идет его неполное окисление.

Регуляция обмена веществ дрожжей кислородом издавна используется в ряде производств: там, где необходима масса дрожжей (получение хлебопекарных и кормовых дрожжей) процессы ведут при аэрации, для получения спирта, глицерина и других метаболитов применяют анаэробное культивирование.

Для определения роста микроорганизмов используется рад методов, которые подразделяются на прямые и косвенные методы определения.

К прямым методам относятся:

определение биомассы весовым методом;

определение количества клеток микроорганизмов при использовании счетной камеры Горяева или при высеве на твердые среды.

При использовании косвенных методов проводят определение массы отдельных компонентов клетки (белок, клеточный азот, нуклеиновые кислоты и др.), массы потребленного субстрата (источника углерода, азота, фосфор, кислорода и др.), массы образуемых продуктов метаболизма или др.

Цель работы заключается в экспериментальном проведении процесса периодического культивирования дрожжей и определении параметров их роста в зависимости от условий культивирования.

Практическая часть

1. Подготовка питательной среды

Состав основной питательной среды (1) для выращивания дрожжей (г/л):

глюкоза – 10,0; (NH4)2SO4 – 3,5; KH2PO4 – 1,0; KCl – 0,5; MgSO47H2O – 0,7;

FeSO4 – 0,15; дрожжевой автолизат – 2; рН – 6,0.

В зависимости от варианта опыта помимо основной питательной среды (1) готовят питательную среду без добавления дрожжевого автолизата, а также среду, содержащую 50% глюкозы, и среду, в которой присутствует только 10% источника фосфора и 10% источника азота от их концентрации в среде 1.

Подготовленная питательная среда стерилизуется при 0,5 атм. 30 мин.

2. Подготовка инокулята (засевного материала) Чистые культуры дрожжей выращивают на скошенном сусло-агаре в течение 48 ч при температуре 30-320С. Инокулятом служит суспензия, полученная смывом стерильной водой культуры дрожжей со скошенного агара (15 мл стерильной воды на одну пробирку двухсуточной культуры).

3. Культивирование микроорганизмов Процесс культивирования микроорганизмов периодическим глубинным способом осуществляется в автоматизированной системе "ФЕРМУС-3Н" в режиме хемостата. Этот режим предполагает, что процесс протекает так, что по всему реакционному объему поддерживается одинаковое и постоянное значение всех параметров процесса. После засева процесс ведут в стерильной питательной среде при 30-320С при 200 об/мин.

4.В динамике определяются параметры роста культуры. Для этого каждые 2 ч при соблюдении стерильности операции отбирается 50 мл суспензии культуры. Необходимо определить следующие параметры: 1) оптическая плотность суспензии (биомасса); 2) количество клеток (в камере Горяева); 3) готовится препарат «раздавленная капля», окрашенный метиленовым синим, и микроскопируется с объективом 40х; 4) содержание редуцирующих сахаров в КЖ; 5) содержание азота в КЖ; 6) содержание фосфора в КЖ.

Опыт заканчивается при снижении прироста биомассы.

5. По мере получения данных строится график – кривая роста (рис. 2), определяется продолжительность лаг-фазы и рассчитывается выход биомассы от заданного субстрата при завершении эксперимента.

lg числа клеток

–  –  –

I – лаг-фаза; II – фаза ускоренного роста; III – фаза логарифмического роста; IV – фаза замедленного роста из-за недостатка источников питания или из-за накопления ингибирующих продуктов; V – стационарная фаза; VI – фаза отмирания клеток Рисунок 2. Кривая роста периодической культуры микроорганизмов Для выполнения работы на первом занятии получают исходные данные для постановки эксперимента (состав питательной среды и начальную концентрацию биомассы), проводят измерения и строят калибровочные кривые для определения количества биомассы, азота и фосфора. Для определения концентрации биомассы вначале опыта измеряют оптическую плотность пробы непосредственно после добавления 10 мл инокулята (смыва дрожжей со скошенного агара). Кроме того, необходимо определить исходное содержание сахара, азота и фосфора в питательной среде до внесения инокулята.

На втором занятии проводят экспериментально периодическое культивирование микроорганизмов. Строят графическую кривую роста, определяют параметры роста (продолжительность лаг-фазы, экономический коэффициент) и описывают морфологию культуры.

Основные параметры роста микроорганизмов:

X концентрация биомассы, г/л;

N число клеток в единице объема (титр культуры, плотность популяции), количество клеток в 1 мл;

удельная скорость роста – прирост биомассы или числа клеток в единицу времени, отнесенный к концентрации биомассы или количеству клеток, ч-1:

dX 1 dN 1 ; ;

dt X dt N

–  –  –

где X увеличение биомассы, соответствующее потреблению субстрата в количестве S.

Результаты опытов, полученные всеми группами студентов необходимо обобщить. Составить общую табл. 1. Сформулировать выводы о влиянии условий культивирования на рост изученных культур микроорганизмов.

–  –  –

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

1. Определение количества биомассы Для количественной оценки роста микроорганизмов при выполнении данной задачи применяют нефелометрический метод. В основе метода лежит измерение светорассеяния (мутности) вызываемого суспензией клеток микроорганизмов.

Величину светорассеяния измеряют с помощью фотоэлектроколориметра. Для определения концентрации биомассы используют калибровочные кривые зависимости между величиной светорассеяния (оптической плотности) суспензии и массой сухой биомассы.

Ход анализа. Для определения концентрации биомассы в начале опыта измеряют оптическую плотность пробы из контрольной колбы непосредственно после добавления 10 мл суспензии – смыва со скошенного агара. Промер осуществляют на фотоэлектроколориметре КФК-2МП с сине-зеленым светофильтром ( =490 нм). Конечную концентрацию биомассы определяют путем промера на ФЭКе суспензий, содержащих 1 мл КЖ из колбы и 9 мл воды.

В случае интенсивного роста возможны дополнительные разведения. По калибровочной кривой, учитывая разведения, пересчитывают показания прибора на массу сухих дрожжей в г/л.

Построение калибровочной кривой проводят следующим образом: из густой суспензии культуры дрожжей (оптическая плотность 2) готовят разведения в 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 и 30 раз. Промеряют величину светорассеяния суспензий на ФЭКе и параллельно в трех различных суспензиях определяют высушиванием концентрацию биомассы дрожжей. На основании полученных данных строят калибровочную кривую, откладывая на оси ординат показания фотоэлектроколориметра, а на оси абсцисс – массу сухих дрожжей в г/л.

Определение концентрации биомассы микроорганизмов производят в несколько стадий. В первой из них от известной массы суспензии микроорганизмов биомассу отделяют фильтрованием на воронке Бюхнера.

Полученный осадок, так называемая прессованная биомасса, содержит 70-80% воды, ее взвешивают и рассчитывают концентрацию прессованной биомассы.

Далее от нее отделяют некоторую часть, взвешивают и высушивают до постоянной массы. Из полученных данных соответствующим расчетом определяют и содержание абсолютно сухой биомассы и суспензии микроорганизмов на различных стадиях биотехнологического процесса (ферментации, сепарации и вакуум-выпарки).

Ход определения. Чистые сухие стеклянные бюксы помещают в сушильный шкаф, нагретый до температуры 105 20С, и выдерживают при этой температуре 30 минут. Крышка бюкса при этом открыта. Затем бюксы закрывают крышками, переносят в эксикатор и после охлаждения до комнатной температуры взвешивают с погрешностью не более 0,0002 г.

Высушенные бюксы хранят в эксикаторе над хлористым кальцием.

Суспензию микроорганизмов тщательно перемешивают и быстро, не давая микроорганизмам осесть, 50-100 мл суспензии наливают в предварительно взвешенный с погрешностью не более 0,01 г стакан. Затем с той же точностью взвешивают стакан с суспензией.

В воронку Бюхнера аккуратно укладывают два фильтра и смачивают их водой. Воронку вставляют в колбу Бунзена, присоединяют ее к вакуум-насосу и отсасывают воду, добиваются того чтобы фильтры плотно прижались к дну воронки. Затем, не отключая вакуума, на фильтр переносят из стакана суспензию микроорганизмов. Оставшиеся на стенках и дне стакана микроорганизмы 400С) смывают в воронку небольшими порциями теплой (около дистиллированной воды. Фильтрование проводят до возможно более полного удаления жидкости.

Если первые порции фильтрата окажутся мутными, то после образования на фильтре плотного осадка микроорганизмов фильтрование прерывают и фильтрат из колбы Бунзена переносят в воронку, смывая остатки микроорганизмов в колбе теплой дистиллированной водой.

После окончания фильтрования вакуум-насос отключают, фильтры с биомассой снимают с воронки и осторожно разделяют. Далее с погрешностью не более 0,01 г взвешивают отдельно верхний фильтр с биомассой и нижний фильтр;

взвешивание производят быстро, не давая фильтрам, особенно нижнему, подсохнуть.

Из прессованной биомассы в предварительно подготовленные и взвешенные бюксы отбирают 0,3-0,5 г биомассы и бюксы с биомассой взвешивают. Оба последних взвешиванию производят с погрешностью не более 0,0002 г.

Бюксы с биомассой помещают в сушильный шкаф, нагретый до температуры 105 20С, и выдерживают при этой температуре 1,5 часа. Крышка бюкса при этом открыта. Затем бюксы закрывают крышками, переносят в эксикатор и охлаждают до комнатной температуры, взвешивают с погрешностью, не более указанной выше.

Проводят два параллельных определения.

Содержание прессованных микроорганизмов (Х1) в процентах рассчитывают по формуле:

m _m Х1 1 2 100, m m

–  –  –

где: m5–масса высушенной биомассы вместе с бюксом, г;

m6 – масса стеклянного бюкса, г;

m7 – масса прессованных микроорганизмов с бюксом, г.

За окончательный результат определения принимают среднюю арифметическую величину двух параллельных определений.

Для построения калибровочного графика необходимо процентную концентрацию абсолютно сухих микроорганизмов перевести на массу сухих дрожжей в г/л, условно считая, что плотность суспензии равна единице.

2. Количественный учет микроорганизмов с помощью счетных камер Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных камерах успешно применяют для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во взвесях (суспензиях).

Известны счетные камеры разных конструкций, принцип устройства которых одинаков (Горяева, Фукс-Розенталя, Петрова-Хауссера, Тома-Цейса и др).

Метод количественного учета микроорганизмов с помощью счетных камер имеет ограничения применения, связанные с тем, что в счетных камерах проводится учет всех клеток микроорганизмов, без их дифференциации на живые и мертвые клетки. Кроме того, счетные камеры могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов – клеток водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопируемых при объективе 8-40х.

Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло с нанесенными на нем поперечными прорезами, которые образуют три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка. Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней. Эти площадки служат для притирания покровного стекла.

Сетка разделена на определенное число больших и маленьких квадратов, поразному сгруппированных. Постоянной величиной во всех сетках является маленький квадрат, сторона которого равна 1/20 мм, площадь его – 1/400 мм2, а объем при высоте камеры 1/10 мм – 1/4000 мм3 или 1/4000000 мл. Так называемый большой квадрат, состоит из 16 малых квадратиков.

Каплю взвеси наносят на сетку камеры и сверху накрывают чистым покровным стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна равномерно без пузырьков распределиться по всей сетке, не выступая в желобок между стенками.

Камеру с исследуемым материалом помещают на предметный столик микроскопа и микроскопируют с объективом 10 – 40х (в поле зрения должны быть отчетливо видны как квадратики, так и клетки микроорганизмов).

Просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах (т.е. в 80 малых), расположенных по диагонали. Учитывают все клетки, размещенные внутри квадрата и на пограничных линиях, если они большей частью лежат внутри квадрата. Клетки, разделенные пограничной линией пополам, считают только на 2-х из 4-х границ квадрата, а клетки лежащие большей своей половиной вне данного квадрата, совсем не учитывают.

Находят среднее количество клеток в одном малом квадрате. Допустим, в 5 больших квадратах (80 малых) – 240 клеток, тогда в одном малом квадрате среднее количество клеток 240:80 = 3.

Пересчет на 1 мл суспензии с учетом разведения производят по формуле:

a 1000 N K, hS где N – число клеток в 1 мл суспензии; а – среднее число клеток в малом квадрате; h – глубина камеры, мм; S – площадь малого квадрата, мм2; К – разведение исходной суспензии; 1000 – коэффициент пересчета мм3 в мл (1 мл = 1000 мм3).

3. Выявление живых и мертвых клеток дрожжей Выявление живых и мертвых клеток дрожжей и грибов проводят на витальных (прижизненных) препаратах «раздавленная капля», окрашенных метиленовым синим, и микроскопируются с объективом 40х;

Для приготовления препарата микроорганизмов на предметное стекло в каплю дрожжевой суспензии вносят каплю красителя метиленового синего, выдерживают не более одной минуты, накрывают покровным стеклом, оттягивают избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют в проходящем свете. Живые клетки, не пропускающие краситель, не окрашены, мертвые клетки синего цвета.

4. Определение содержания редуцирующих сахаров в культуральной жидкости по методу Бертрана Сахара, содержащие свободные альдегидные или кетонные группы в щелочных условиях, восстанавливают растворы оксида меди (II) до оксида меди (I), выпадающего в осадок. Количество оксида меди (I) может быть учтено как весовым, так и объемным методом. Последний был предложен Бертраном и получил широкое распространение в микробиологической промышленности.

Метод позволяет определить содержание редуцирующих сахаров от 10 до 100 мг в пробе. Эмпирическим путем составлены таблицы, в которых даны количественные соотношения между восстановленной медью и соответствующим сахаром. В данном пособии приводится таблица соответствия для одного сахара – глюкозы (табл. 2).

При кипячении с щелочным раствором оксида меди (II) за счет присутствующего сахара образуется осадок оксида меди (I), который обрабатывается подкисленным серной кислотой раствором сернокислого оксида железа (II).

При этом оксид меди (I) превращается в оксид меди (II), а железо восстанавливается:

Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 = 2 CuSO4 + 2 FeSO4 + H2O.

Количество восстановленного железа определяют титрованием раствора перманганатом калия:

10 FeSO4 + 2 KMnO4 + 8 H2SO4 = 5 Fe2(SO4)3 + K2SО4 + 2 MnSO4 + 8 H2O.

Титр перманганата калия устанавливают по щавелевой кислоте:

5 C2H5O4 + 2 KМnO4 + 3 H2SO4 = 10 CO2 + 2 MnSO4 + 8 H2O.

Ход определения. В коническую колбу на 200 мл вносят 20 мл испытуемого раствора, содержащего не более 100 мг глюкозы. Если количество сахара превышает допустимый предел, то производят необходимые разведения. К раствору сахара добавляют 20 мл Фелинга I и 20 мл Фелинга II, перемешивают и кипятят в течение 3 мин, накрыв колбу часовым стеклом. Если после кипения синяя окраска жидкости отсутствует, пробу следует переделать, так как в ней содержится более 100 мг сахара.

Образовавшемуся осадку оксида меди (I) дают отстоятся, после чего жидкость фильтрую через воронку Бюхнера, вставленную в колбу Бунзена при слабом отсасывании водоструйным насосом. Сливают жидкость на фильтр по стеклянной палочке путем декантации, стараясь не переносить осадок на фильтр.

Раствор в колбе нельзя взбалтывать. Осадок в колбе и на фильтре не должен оставаться без жидкости, так как при соприкосновении с воздухом закись меди может окисляться.

Осадок закиси меди в конической колбе промывают 3-4 раза (порциями по 20-30 мл) водой, декантируя жидкость через тот же фильтр. Оставив на фильтре немного жидкости над осадком, отключают насос. Колбу с фильтратом и промывными водами удаляют и под фильтр подставляют другую колбу Бунзена, не включая насоса.

Осадок закиси меди, оставшийся в колбе, растворяют в 40-50 мл раствора железоаммонийных квасцов и небольшими порциями переливают на фильтр и слегка помешивают стеклянной палочкой для растворения попавшего на фильтр осадка закиси меди (весь осадок закиси меди должен быть растворен). После стекания последних капель раствора колбу и фильтр 3-4 раза промывают небольшими порциями холодной воды, которую также собирают во вторую колбу с фильтратом. Содержимое второй колбы Бунзена зеленого цвета титруют раствором марганцовокислого калия до устойчивой слаборозовой окраски.

Расчет количества сахара производят следующим образом:

1) Определение количества мг меди в пробе:

–  –  –

где g – навеска щавелевокислого натрия, мг; V – количество KMnO4, пошедшее на титрование, мл; 0,9488 – коэффициент перевода количества щавелевокислого натрия на количество меди, мг (для щавелевой кислоты коэффициент 1,0087).

Приготовление реактивов:

1) раствор Фелинга № 1: 4% раствор сернокислой меди в дистиллированной воде.

2) раствор Фелинга № 2: 20% раствор сегнетовой соли, содержащий 150г NaOH в 1 л воды.

3) раствор железоаммонийных квасцов: 10% раствор железоаммонийных квасцов [FeNH4(SO4)2] 12H2O, содержащий в 1 л 100 мл концентрированной H2SO4.

4) 0,1 н. раствор перманганата калия 1 мл которого соответствует 10 мг Cu. 5 г химически чистого KMnO4 растворяют в 1 л воды и устанавливают титр.

–  –  –

5. Определение содержания азота в культуральной жидкости и растворах питательных солей Метод основан на фотоколориметрическом определении иодистого меркураммония, образующегося при взаимодействии иона аммония с реактивом Неслера в щелочной среде.

Определению мешают ионы кальция и магния, которые осаждают прибавлением раствора сегнетовой соли.

Метод предназначен для определения аммонийного азота в суспензии микроорганизмов на стадии ферментации и в водных растворах питательных солей.

Порядок проведения работы

1. Подготовка к определению.

Построение калибровочного графика.

Подготовка аммония сернокислого 1.1.

В фарфоровую чашку насыпают 2-5 г сернокислого аммония. Чашку с солью помещают в сушильный шкаф, нагретый до температуры 105 ± 2 0С, и выдерживают при этой температуре 1-1,5 часа. Чашку охлаждают в эксикаторе над хлористым кальцием и взвешивают с погрешностью не более 0,0002 г. Далее высушивание повторяют так, как было описано выше, выдерживая чашку в сушильном шкафу в течение 30-40 мин, охлаждают в эксикаторе и взвешивают.

Если масса чашки с солью после повторного высушивания отличается от массы, полученной после первого высушивания не более, чем на 0,0004 г, высушивание считают законченным. В случае, если масса уменьшилась более, чем на 0,0004 г, то необходимо дополнительное высушивание в течение 30-40 минут. Такое дополнительное высушивание повторяют столько раз, сколько необходимо для достижения постоянной массы.

1.2. Приготовление основного раствора аммония сернокислого(раствор А) В стаканчике (бюксе) отвешивают, с погрешностью не более 0,0002 г, 0,9428г аммония сернокислого, приготовленного по п. 1.1. Соль через воронку пересыпают в мерную колбу вместимостью 1 л. Остатки соли в стаканчике и на воронке смывают в колбу дистиллированной водой. Встряхивая колбу, перемешивают ее содержимое до полного растворения соли. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой, колбу закрывают пробкой и перемешивают.

В 1 л полученного раствора содержится 200 мг азота или 500 мг NH4ОН.

1.3 Приготовление рабочих растворов аммония сернокислого Рабочие растворы аммония сернокислого с определенной концентрацией азота готовят в мерных колбах соответствующим разведением раствора А. Для этого в десять пронумерованных мерных колб вместимостью 100 мл пипетками вносят необходимое количество раствора, указанного в графе 2 табл. 3.

Таблица 3 №№ Объем раствора А, Концентрация азота в рабочем растворе колб вносимого в колбу, в пересчете на:

мл азот, мг/ л NH4ОН,мг/ л Объемы в колбах доводят дистиллированной водой до метки, колбы закрывают пробками и содержимое их перемешивают. Концентрация азота в каждом из приготовленных растворов указана в графе 3 табл. 3.

1.4 Построение калибровочного графика В пробирки с пришлифованной пробкой вместимостью 20 мл пипеткой вносят по 1 мл каждого из приготовленных растворов. Затем в каждую пробирку пипеткой или из бюретки добавляют 15 мл дистиллированной воды и 1 мл реактива Неслера. Пробирки закрывают пробками и содержимое перемешивают.

Далее измеряют оптическую плотность окрасившихся в желтый цвет растворов.

При измерении оптической плотности на фотоэлектроколориметре применяют синий светофильтр и кюветы с толщиной поглощающего света слоя 5 мм. При измерении на спектрофотометре при длине волны 440 нм в кюветах с толщиной поглощающего света слоя 10 мм. В качестве растворов сравнения используют раствор, содержащий 16 млводы и 1 мл реактива Неслера.

Для каждой концентрации азота готовят два раствора и проводят два параллельных измерения оптической плотности, принимая за окончательную величину среднюю арифметическую величину этих измерений, значения которых не должны отличаться от средней величины более чем на 3% относительных.

По полученным данным строят калибровочный график, откладывая по оси ординат показания оптической плотности, а по оси абсцисс содержание азота или NH4OH в мг/л. График должен иметь вид прямой линии, проходящей через начало координат.

1.5 Приготовление раствора сегнетовой соли В коническую колбу отвешивают 60 ± 0,05 г сегнетовой соли, добавляют 100 мл дистиллированной воды, 5 мл реактива Неслера и содержимое колбы перемешивают до полного растворения соли.

2. Проведение определения Суспензию микроорганизмов тщательно перемешивают и КЖ отделяют от биомассы фильтрованием через бумажный фильтр или центрифугированием.

Анализируемые растворы должны содержать азот в концентрации не более 200 мг/л, лучше всего в пределах 60-160 мг/л, поэтому, при необходимости, растворы разводят дистиллированной водой с применением мерных колб и пипеток соответствующей вместимости.

От профильтрованной и, если необходимо, разбавленной анализируемой жидкости пипеткой отбирают 1 мл пробы, переносят ее в пробирку с пришлифованной пробкой, туда же с помощью пипеток или из бюреток вносят 15 мл дистиллированной воды и 1 мл реактива Неслера.

Если при прибавлении к исследуемому раствору реактива Неслера появляется опалесценция, необходимо повторить определение, добавив к 1 мл исследуемого раствора 1 мл раствора сегнетовой соли, 14 мл дистиллированной воды и 1 мл реактива Неслера.

Пробирку закрывают пробкой, содержимое перемешивают энергичным встряхиванием и затем измеряют величину оптической плотности. Как описано при построении калибровочного графика.

Для каждого раствора производят два измерения, за окончательную величину оптической плотности принимают среднее арифметическое значение из этих измерений.

Проводят два параллельных определения.

По калибровочному графику для каждого из полученных средних значений оптической плотности каждого параллельного определения находят содержание азота (или NH4OH) в пробе в мг/л. В случае, если производилось разведение пробы, значение, полученное по калибровочному графику, умножают на коэффициент, величину которого рассчитывают по формуле: К=V1/V2, где V1 объем мерной колбы, в которой производилось разведение, мл, а V2 объем пробы, взятой на разведение, мл.

За окончательный результат определения среднюю арифметическую величину двух параллельных определений.

Правильность проведения анализа определяют по расхождению между результатами параллельных определений и их средней арифметической величиной, которое не должно превышать 3% относительных. Величину этого расхождения рассчитывают с точностью до целых единиц.

6. Определение содержания фосфора в культуральной жидкости и растворах питательных солей Метод основан на получении фосфорно-молибденовой кислоты, восстановлении в ней молибдена аскорбиновой кислотой до низших степеней валентности с образованием -формы кислоты и определении ее концентрации спектрофотометрически.

Метод предназначен для определения аммонийного фосфора в расчете на элемент или Р2О5 всуспензии микроорганизмов на стадии ферментации и в водных растворах питательных солей.

Порядок проведения работы

1.Подготовка к определению.

Построение калибровочного графика.

1.1. Подготовка калия фосфорнокислого однозамещенного В фарфоровую чашку насыпают 5-6 г калия фосфорнокислого однозамещенного. Чашку с солью помещают в сушильный шкаф, нагретый до температуры 105 ± 20С, и выдерживают при этой температуре 1-1,5 часа. Чашку охлаждают в эксикаторе над хлористым кальцием и взвешивают с погрешностью не более 0,0002 г. Далее высушивание повторяют так, как было описано выше, выдерживая чашку в сушильном шкафу в течение 30-40 мин, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Если масса чашки с солью после повторного высушивания отличается от массы, полученной после первого высушивания не боле, чем на 0,0004 г, высушивание считают законченным. В случае, если масса уменьшилась более, чем на 0,0004 г, то необходимо дополнительное высушивание в течение 30-40 минут. Такое дополнительное высушивание повторяют столько раз, сколько необходимо для достижения постоянной массы.

Высушенную соль хранят в эксикаторе над хлористым кальцием.

1.2. Приготовление основного раствора калия фосфорнокислого однозамещенного (раствор А).

Основной раствор калия фосфорнокислого однозамещенного КН2РО4 готовят по ГОСТ 4212-76. В стаканчик (с погрешностью не более 0,0002 г) отвешивают 4,3930 г калия фосфорнокислого однозамещенного квалификации х.ч., приготовленного по п.1.1. Соль через воронку пересыпают в мерную колбу вместимостью 1 л. Остатки соли в стаканчике и на воронке смывают в колбу дистиллированной водой. Встряхивая колбу, перемешивают ее содержимое до полного растворения соли. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой, колбу закрывают пробкой и перемешивают.

В 1 л полученного раствора содержится 1,0000 г фосфора или 2,2900 г Р2О5.

Раствор хранят в полиэтиленовой посуде.

1.3. Приготовление промежуточного раствора калия фосфорнокислого однозамещенного (раствор Б).

Пипеткой вносят в мерную колбу (вместимостью 100 мл) 10 мл раствора А.

приготовленного по п.1,2, объем раствора доводят до метки дистиллированной водой, колбу закрывают пробкой и раствор перемешивают. В 1 л раствора Б содержится 100 мг фосфора или 229 мг Р2О5.

1.4. Приготовление раствора молибденовокислого аммония В мерную колбу вместимостью 1 л вносят 300 мл дистиллированной воды и осторожно при перемешивании добавляют 144 мл концентрированной серной кислоты. После охлаждения раствора до комнатной температуры при перемешивании в него добавляют раствор 10 г сульфаминовой кислоты в 100 мл дистиллированной воды и раствор 12,5 г молибденовокислого аммония в 200 мл воды. Затем к раствору в колбе добавляют 100 мл раствора, содержащего 0,235 г хлорида сурьмы и 0,6 г винной кислоты. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой, колбу закрывают пробкой и ее содержимое перемешивают.

1.5. Приготовление раствора аскорбиновой кислоты В стаканчике взвешивают 10±0,05 г аскорбиновой кислоты и через воронку пересыпают в мерную колбу вместимостью 100 мл. Остатки кислоты в стаканчике и на воронке смывают в колбу дистиллированной водой. Встряхивая колбу, перемешивают ее содержимое до полного растворения кислоты. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой, колбу закрывают пробкой и ее содержимое перемешивают. Раствор хранят в холодильнике не более 30 дней.

1.6. Построение калибровочного графика Для построения калибровочного графика готовят серию растворов с определенной концентрацией фосфора разбавлением раствора Б водой.

Необходимые количества раствора Б и воды для получения растворов нужной концентрации приведены в табл. 4. В пробирки с пришлифованной пробкой пипеткой или микробюреткой вносят определенные количества раствора Б (графа 2 табл. 4). Объем в каждой пробирке доводят до 1 мл, добавляя пипеткой или из микробюретки соответствующие (указанные в графе 3 табл. 4) количества дистиллированной воды. Пробирки закрывают пробками и содержимое перемешивают. Концентрации фосфора в каждой из приготовленных растворов указаны в графах 4 и 5 табл. 4.

Затем в каждую пробирку пипеткой или из бюретки добавляют 15 мл дистиллированной воды и 2 млраствора молибденовокислого аммония, приготовленного по п. 1.4. Пробирки закрывают пробками и содержимое перемешивают.

Через 1 минуту к раствору в пробирках добавляют пипеткой 0,5 мл раствора аскорбиновой кислоты, приготовленного по п.1.5. Пробирки закрывают пробками, их содержимое перемешивают и оставляют на 15 минут.

По истечении этого времени измеряют оптическую плотность окрасившихся в синий цвет растворов по отношению к дистиллированной воде.

При измерении оптической плотности на фотоэлектроколориметре применяют красный светофильтр и кюветы с толщиной поглощающего света слоя 3 мм. При измерении на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной поглощающего света слоя 10 мм.

Для каждой концентрации фосфора готовят два раствора и проводят два параллельных измерения оптической плотности, принимая за окончательную величину среднюю арифметическую величину этих четырех измерений, значения которых не должны отличаться от средней величины более, чем на 3% относительных.

Интенсивность развивающейся окраски зависит от времени, поэтому следует добавлять реактивы не более чем к 4-6 пробам одновременно и при этом выдерживать указанные выше интервалы времени.

–  –  –

По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат показания оптической плотности, а по оси абсцисс - содержание фосфора или Р2О5 в мг/л. График должен иметь вид прямой линии, проходящей через начало координат.

2. Проведение определения Суспензию микроорганизмов тщательно перемешивают и КЖ отделяют от биомассы фильтрованием через бумажный фильтр или центрифугированием.

Растворы питательных солей, если они содержат взвешенные частицы или мутны, также осветляют фильтрованием или центрифугированием.

Анализируемые растворы должны содержать фосфор, в расчете на Р2О5, в концентрации не более 209 мг/л, лучше всего в пределах 50-190 мг/л, поэтому, при необходимости, растворы разводят дистиллированной водой с применением мерных колб и пипеток соответствующей вместимости.

От профильтрованной и, если необходимо, разбавленной анализируемой жидкости пипеткой отбирают 1 мл пробы, переносят ее в пробирку с пришлифованной пробкой, туда же с помощью пипеток или из бюреток вносят 15 мл дистиллированной воды.

Далее в пробирку добавляют реагенты в той последовательности, как было указано при построении калибровочного графика, строго соблюдая временные интервалы, необходимые для протекания реакций. После прибавления реактивов и соответствующей выдержки производят измерения оптической плотности раствора точно в тех же условиях, как это проводилось для построения калибровки.

Для каждого раствора производят два измерения, за окончательную величину оптической плотности принимают среднее арифметическое значение из этих измерений, отклонение которых от среднего не должны отличаться более чем на 3% относительных.

Проводят два параллельных определения.

По калибровочному графику находят содержание фосфора (или Р2О5) в пробе в мг/л. В случае если производилось разведение пробы, значение, полученное по калибровочному графику, умножают на коэффициент, величину которого рассчитывают по формуле: К=V1/V2, где V1 объем мерной колбы, в которой производилось разведение, мл; V2 объем пробы, взятой на разведение, мл.

За окончательный результат определения среднюю арифметическую величину двух параллельных определений.

Правильность проведения анализа определяют по расхождению между результатами параллельных определений и их средней арифметической величиной, которое не должно превышать 3% относительных. Величину этого расхождения рассчитывают с точностью до целых единиц.

Устройство и принцип работы автоматизированной системы «ФЕРМУС - ЗН»

Ферментер выполнен в настольном варианте в виде емкости, снабженной перемешивающим устройством и пенорегулятором (пеногасителем). На рис.1 изображена конструкция ферментера РФ - 2.10 и перечень съемных узлов и деталей.

На основании (нижнем фланце) устанавливается кварцевый цилиндр, формирующий рабочий объем ферментера.

Для обжима банки верхним и нижним фланцами используются резиновые прокладки (кольца) обеспечивающие герметизацию объема ферментера и предохраняющие стекло от повреждения.

Усилие прижима фланцев к стеклу определяется усилием стягивания с помощью шпилек и навинчивающихся на них гаек.

Основным рабочим элементов перемешивающего устройства является узел, состоящий из магнитного диска (полумуфтой магнитной) и вмонтированного в него вала с мешалками. Опорой всего узла служит подпятник.

Для гашения пены, возникающей при интенсивном вращении мешалок, служит диск, закрепленный на оси двигателя пеногасителя.

Вал с мешалками приводится во вращение воздействием извне вращающимся магнитным диском, являющимся элементом конструкции привода ферментера — унифицированный узел, предназначенный для обеспечения определенных режимов работы ферментера.

Конструкция позволяет свести к минимуму перепад давлений в локальных зонах потоков, обеспечить равномерность плотности биомассы и субстрата, интенсивное перемешивание культуральной жидкости (КЖ).

Перенос кислорода увеличивается отбойными стойками, устанавливаемыми в ферментер, которые повышают уровень микро- и макротурбулентности.

Характер циркуляции (движения потоков) КЖ может быть изменен путем замены или комбинации мешалок, комплектующий данный ферментер.

Охлаждение КЖ в биореакторе осуществляется пропусканием холодной воды через водяную рубашку нижнего фланца, имеющего входной и выходной штуцеры.

Ферментер пригоден для реализации ряда технологических процессов:

аэробных;

периодических и непрерывных;

стерильных и нестерильных.

1 - привод пеногасителя, 2 - электрод в оправе, 3 - гайка накидная 008, 4 – гайка накидная 015, 5 - диск, 6 - отбойник, 7 - мешалка 01,8- вал, 9 - мешалка, 10 гайка, 11 - полумуфта магнитная, 12 - распылитель, 13 - втулка, 14 - шайба, 15 подпятник, 16 - гайка, 17 - фланец нижний, 18 - прокладка, 19 - цилиндр стеклянный, 20 - шпилька, 21 - фланец, 22 - прокладка, 23 - крышка, 24 - ручка

–  –  –

Рисунок 4 Внешний вид ферментационной установки «ФЕРМУС - ЗН»

Глубинное культивирование микроорганизмов требует создания необходимых условий для их жизнедеятельности, которые поддерживаются в биореакторе. К числу управляемых параметров культивирования относятся температура, рН и содержание растворенного кислорода в КЖ.

Контур поддержания заданной температуры состоит из датчика платинового термометра сопротивления ТСП-1СЮ, который через верхний фланец биореактора вставлен в трубку из нержавеющей стали, погруженную в КЖ, регулятора, организованного в программном виде в блоке управления, и исполнительных устройств - нагревателя и контура охлаждения.

Нагреватель представляет из себя кольцевую электрическую плитку, которая одновременно служит опорной площадкой для установки биореактора.

Нижний фланец биореактора имеет тепловой контакт с плиткой.

Охлаждение КЖ в биореакторе осуществляется путем пропускания холодной водопроводной воды через полые отбойники. В биореакторе размещены два независимых контура охлаждения, имеющие входные и выходные штуцеры, расположенные на нижнем фланце. В зависимости от выделяемой культурой тепловой мощности и перепада температур между КЖ и окружающим воздухом можно использовать один или два контура охлаждения.

Для обеспечения заданной точности поддержания температуры выбран закон пропорционально-интегрального регулирования. Исполнительные механизмы контура поддержания заданной температуры работают в импульсном режиме с широтно-импульсной модуляцией.

Для быстрого нагрева ферментера или его охлаждения на базовом блоке предусмотрена возможность ручного включения нагревателя (Т°), либо клапана охлаждения воды (T°,) соответствующими клавишами.

Контур поддержания заданного значения рН КЖ состоит из датчика рН, программно организованного регулятора в блоке управления и перистальтических насосов подачи титрантов - кислоты и щелочи.

Датчик рН состоит из двух электродов - измерительного (стеклянного) и вспомогательного - электролитического ключа заключенных в трубки из нержавеющей стали. Они вставляются в отверстия в верхнем фланце ферментера и при работе должны быть погружены в КЖ не менее чем на 1/4 длины.

Датчики кабелями соединяются с разъемами на задней панели блока управления. В блоке управления используется аналого-цифровой преобразователь (АЦП), общая точка которого соединена с корпусом установки и с корпусом ферментера.

В установке «Фермус-3Н» измерение рН с использованием стеклянных ионоселективных электродов основано на определении разности потенциалов между внутренней и внешней поверхностями стеклянного шарика электрода рН.

В установке измеряется потенциал внутренней поверхности стеклянного шарика относительно корпуса ферментера (стеклянный электрод) и потенциал внешней поверхности стеклянного шарика относительно корпуса ферментера (вспомогательный хлорсеребряный электрод).

Измеренные АЦП значения потенциалов вычитаются в ЭВМ блока управления и полученный результат используется для вычисления истинного значения рН КЖ в единицах рН. Крутизна характеристики стеклянного электрода зависит от температуры (прямая характеристики вращается вокруг изопотенциальной точки, которая по "умолчанию" имеет координаты Еи=30 мв, рНи=1,7ед.). Блок управления при помощи клавиши "К" позволяет при смене тип;

датчика вводить новое значение координаты рН и изопотенциальной точки.

Координата Еи вычисляется процессором после проведения калибровки нового типа датчика по двум точкам. Ввиду того, что для коррекции температурной зависимости датчика рН используется канал измерения температуры, при калибровке датчики рН и температурный должны иметь одинаковую температуру.

Следует иметь ввиду, что измерение рН возможно только в том случае, если контролируемая жидкость имеет контакт с металлической поверхностью, соединенной с корпусом блока управления. Поэтому при калибровке электродов рН необходимо соединить корпус датчиков (трубку из нержавеющей стали) с корпусом блока управления. Корпус ферментера обязательно должен быть соединен с корпусом блока управления.

К выходам блока управления (разъемы "кислота" и "щелочь") подключаются кабелем входы дистанционного управления перистальтических насосов, подающих в ферментер соответствующие титранты. Так же, как и в контуре регулировании температуры, закон регулирования рН пропорционально-интегральный. Для управления насосами используется широтно-импульсная модуляция.

Контур поддержания заданного значения процентного содержания растворенного кислорода состоит из полярографического датчика парциального давления растворенного кислорода, программного регулятора в блоке управления исполнительных механизмов - перемешивающего устройства и управляемого вентиля подачи воздуха на аэрацию.

Алгоритм работы этого контура соединяет в себе пропорциональноинтегральный закон для управления скоростью перемешивания и дискретное управление расходом аэрирующего воздуха.

Для обеспечения оптимального роста микроорганизмов часто бывает необходимо ограничить как максимальную, так и минимальную скорость вращения перемешивающего устройства.

Значения Nmin, Nmax по "умолчанию" равны Nmin =0, Nmax =1200 об/мин. Новые значения Nmin, Nmax вводятся при необходимости с передней панели блоке управления. Ограничение скорости снизу (Nmin) необходимо для того, чтобы осуществлять перемешивание в случае, когда рО2 КЖ больше заданного (например, в лаг-фазе, когда концентрация микроорганизмов мала) Ограничение сверху (Nmax) необходимо при культивировании некоторых штаммов чувствительных к механическим воздействиям.

Управление положением вентиля расхода воздуха для аэрации КЖ осуществляется следующим образом.

При недостатке кислорода, когда скорость вращения мешалки становится равной Nmax, на короткое время (~0,3 сек) включается двигатель привода вентиля увеличивающий на некоторую величину расход воздуха. Если при этом обороты мешалки не уменьшились, через некоторое время (~4сек) вентиль опять приоткрывается. Если концентрация растворенного кислорода достигла установленного значения, обороты мешалки уменьшились (меньше Nmax), привод вентиля больше не включается.

При избытке кислорода, когда скорость вращения мешалки становится равной Nmin, двигатель привода вентиля регулирует вентиль на уменьшение подачи. Если при этом скорость вращения мешалки не увеличилась, дискретное регулирование вентиля на уменьшение подачи воздуха продолжается с периодом ~4сек.

При увеличении оборотов мешалки, т.е. когда NNmin, работа привода вентиля прекращается.

На передней панели базового блока имеются клавиши управления двигателей привода вентиля расхода воздуха (B и В ) для ручного закрывания и открывания этого вентиля. Для ручной установки скорости вращения перемешивающего устройства предусмотрена клавиша включения ручного режима ("М") и ручка установки скорости ("М").

Установка позволяет (если режим поддержания концентрации растворенного кислорода не используется) задавать скорость вращения перемешивающего устройства с передней панели блока управления. При этом заданное значение рО2 должно быть "000".

Система поддержания уровня пены не выше заданного уровня состоит из датчика наличия пены, подключенного к блоку управления, диска механического пеногасителя, соединенного через магнитную муфту с двигателем пеногасителя и насоса подачи химического пеногасителя в ферментер.

Датчик пены - контактный. Как только пена, поднимаясь над КЖ, касается нижней части датчика, в блоке управления вырабатывается сигнал наличия пены.

При наличии этого сигнала через 4 секунды включается двигатель привода механического пеногасителя и диск, вращающийся с большой скоростью, разбивает пузыри пены и отбрасывает жидкость на стенки ферментера. Если пена в течении 8 секунд не сбивается, на вход дистанционного управления насоса подачи химического пеногасителя поступает короткий импульс, соответствующий подаче в ферментер примерно 0,5 мл химического пеногасителя.

Если через 8 секунд пена не спадает, подача химического пеногасителя повторяется. При спадании пены выключается двигатель пеногасителя. На передней панели базового блока имеется клавиша ручного включения двигателя пеногасителя.

Наличие в составе установки 3-х автономных перистальтических насосов с дистанционным управлением позволяет организовать, при необходимости, раздельную подачу двух компонентов питательной среды или других жидкостей, используя для управления двумя насосами выходы сигналов "проток1" и "проток2".

Производительность этих насосов задается с передней панели блока управления по каналам VI и V2 соответственно. Подача жидкости импульсная с широтно-импульсной модуляцией. Расход устанавливается в относительных единицах от 0 до 999.

Измерение окислительно-восстановительного потенциала производится с использованием датчика еН и хлорсеребряного (вспомогательного) электрода датчика рН. Датчик еН представляет собой стеклянную запаянную трубку, в торец которой вварены два платиновых электрода. Между электродами приложено напряжение ~ЗВ частотой 50Гц синусоидальной формы. Напряжение датчика окислительно-восстановительного потенциала снимается со средней точки деполяризующей обмотки, расположенной на силовом трансформаторе блока управления.

Окислительно-восстановительный потенциал КЖ вычисляется ЭВМ блока управления как разность двух напряжений, датчика еН относительно корпуса ферментера и датчика вспомогательного электрода рН относительно корпуса ферментера.

Порядок работы Перед началом культивирования, до стерилизации ферментера, датчиков и соединительной арматуры ферментера, провести калибровку измерителей и, если необходимо, насосов VI и V2 подачи компонентов питательной среды в ферментер.

Проверить и при необходимости откалибровать измеритель температуры КЖ по одной точке в режиме "ПУСК". Для этого включить установку в сеть, включить питание блока управления, затем базового блока. Поместить эталонный термометр в свободное отверстие верхнего фланца ферментера так, чтобы он погрузился в жидкость нижней частью. Нажать на блоке управления клавишу "ПУСК". Установить блок управления в режим индикации температуры, нажав клавиши "Т" и "ИЗМ". Сравнить показания индикатора с эталонным термометром. Если разность показаний находится в пределах допустимой погрешности, калибровку проводить не требуется. В противном случае провести калибровку канала измерения температуры.

Для этого перевести блок управления в режим калибровки температуры, нажав клавишу "КЛБ" и ввести с помощью цифровой клавиатуры показание эталонного термометра с точностью до десятых долей градуса.

Ввод калибровочного значения заканчивается нажатием клавиши "ВВОД".

Через некоторое время (порядка 5 секунд) блок управления коротким звуковым сигналом оповещает оператора, что калибровка закончена. Проверить правильность показаний измерителя температуры, переключив блок в режим индикации температуры. Убедиться, что показания индикатора совпадают с показаниями эталонного термометра.

–  –  –

Проверить и при необходимости откалибровать измеритель рН.

Для этого приготовить три буферных раствора с известными значениями рН, например:

4,01; 6,86; 9,18.

Вынуть измерительный и вспомогательный электроды из ферментера, промыть их в дистиллированной воде и укрепить вместе на штативе.

Проводником из комплекта ЗИП соединить корпус одного электрода с клеммой заземления блока управления. Погрузить нижнюю часть электродов в известный буфер. Установить блок управления в режим измерения рН, нажав клавиши "ИЗМ" и "рН". Сравнить показания индикатора со значением рН буферного раствора. Если ошибка измерения находится в допустимых пределах, калибровку проводить не требуется. В противном случае желательно провести калибровку измерителя по двум точкам. Калибровку по двум точкам (в режиме "СТОП") необходимо проводить также в случае замены датчиков на другую серию или тип.

Калибровка проводится следующим образом. Поместить электроды в буферный раствор с рН=4,01. Наблюдая за индикатором в режиме измерения рН, дождаться установления стабильных показаний. При этом показания могут не соответствовать истинному значению рН буфера и даже заметно отличаться от него. После установления стабильных показаний индикатора, перевести блок управления в режим калибровки, нажав клавишу "КЛБ" и ввести значение первой калибровочной точки с помощью цифровой клавиатуры (например: 4,01) закончив нажатием клавиши "Ввод". После запоминания координат первой точки блок управления выдает короткий звуковой сигнал, который информирует о том, что можно вводить вторую калибровочную точку. Промыть электроды дистиллированной водой, осушить фильтрованной бумагой и поместить во второй буферный раствор. Для достижения максимальной точности калибровки значения рН первого и второго буферов должны отличаться не менее чем на 3 единицы рН.

Для наблюдения за установлением показаний переключите индикатор блока управления в режим измерения рН, нажав клавишу "ИЗМ". После установления стабильных показаний (они могут после введения первой точки заметно отличаться от истинных — не обращайте на это внимания).

Снова переключить блок управления в режим калибровки, нажав клавишу "КЛБ". Ввести значение рН буферного раствора, в котором находятся электроды.

После того, как через 4-5 секунд прозвучит короткий звуковой сигнал, калибровка по двум точкам закончена. Для контроля правильности проведенной работы переключите индикатор блока управления в режим измерения рН, нажав на клавишу "ИЗМ". Индикатор должен показывать истинное значение рН.

Проверьте правильность работы измерителя, поместив электроды в буферный раствор с промежуточным значением рН (например: 6,85).

Калибровка по двум точкам в соответствии, с программой, "зашитой" в ПЗУ, может быть проведена только один раз. В том случае, если возникнет необходимость в повторной калибровке измерителя рН (либо другого измерителя) по двум точкам, необходимо выключить блок управления и отключить питание энергонезависимой памяти (тумблер "память" на задней панели блока управления переключить в нижнее положение). Через 10-15 секунд вновь включить питание блока и тумблер памяти и продолжить работу. Следует помнить, что при выключении тумблера "память" стирается вся введенная оператором информация, результаты калибровок, значения уставок, минимумов, максимумов и др.

Калибровка измерителя рН по одной точке производится, если необходимо в небольших пределах скорректировать показания. Например, после стерилизации датчиков в автоклаве может сдвинуться изопотенциальная точка.

Эта калибровка удобна, когда датчик находится в стерильных условиях и его нельзя извлечь из ферментера для калибровки.

В процессе культивирования отобрать из ферментера пробу КЖ и измерить ее рН на эталонном рН-метре. Переключить блок управления в режим калибровки рН, нажав клавишу "КЛБ". Блок управления при этом находится в состоянии "ПУСК" горит светодиод над этой клавишей.

С помощью цифровой клавиатуры ввести показания эталонного рН-метра.

Через 4-5 секунд коротким звуковым сигналом блок управления сигнализирует об окончании калибровки. Переключив индикатор блока в режим индикации рН, убедиться в том, что показания на табло соответствуют показанию эталонного рН-метра.

Работа блока управления не зависит от того, в каком состоянии "СТОП" или "ПУСК" - вводятся минимальные и максимальные границы параметров. Однако, для работы регуляторов рН, Т, рО2 небезразлично, в каком состоянии блока управления "СТОП" или "ПУСК" вводятся уставки параметров (заданные для поддержания значения).

В режиме "ПУСК" при изменении уставки использован "безударный" переход, то есть после ввода оператором нового значения уставки не сразу используется в расчете управляющего воздействия, и значение уставки в регуляторе постепенно, в течение нескольких минут доводится до введенной оператором величины.

Следует помнить, что в режиме "ПУСК" после ввода новой уставки реакции исполнительного устройства (нагревателя, насосов) можно ожидать только через некоторое время (не более 3 минут).

После того, как введена вся необходимая информация, перед включением блока в режим регулирования параметров процесса "ПУСК", убедиться в том, что базовый блок и насосы включены в сеть, а в магистрали охлаждающей воды достаточное давление. Нажать клавишу "ПУСК".

По окончании процесса культивирования, нажать клавишу "СТОП", отключить разъемы всех датчиков от блока управления, промыть шланги и ферментер.При выключении питания (при включенном тумблере "память") введенная в процессе работы оператором информация сохранится в памяти до следующего включения.

Рекомендуемая литература

1. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. – М.: Изд-во МГУ, 1994. – 513 с.

2. Медицинская микробиология / Под ред. Покровского В.И., Поздеева О.К. – М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. – 1200 с.

3. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. проф.

Егорова Н.С. – М.: Изд-во МГУ, 1983. – 221 с.

4. Практикум по микробиологии / Под. ред. Нетрусова А.И. – М.:

Издательский центр «Академия», 2005. – 608 с.

5. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б., Гусарова Н.А. Лабораторный



Похожие работы:

«Гордиенко Павел Владимирович МОДЕЛИРОВАНИЕ НЕСТАЦИОНАРНЫХ НЕЙТРОННОФИЗИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В РЕАКТОРАХ ВВЭР С ПОТВЭЛЬНОЙ ДЕТАЛИЗАЦИЕЙ Специальность 05.14.03 – Ядерные энергетические установки, включая проектирование, эксплуатацию и вывод из эксплуатации. АВТОРЕФЕРАТ диссер...»

«АЗАСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫ МЕМЛЕКЕТТІК СТАНДАРТЫ АЗАСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫ МЕМЛЕКЕТТІК ТУЫ Жалпы техникалы шарттар ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ФЛАГ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН Общие технические условия Р СТ 988-2007 Ресми басылым азастан Республикасы Индустрия жне сауда министрлігіні Техни...»

«ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ УДК 664.3.033 Совершенствование техники и технологии производства сливочного масла методом непрерывного сбивания сливок Раттур Елена Владимировна, аспирант e-mail: rattur87@mail.ru Фед...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования УТВЕРЖДАЮ Ректор Уральского федерального университета име...»

«УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ ГУМАНИТАРНЫЕ НАУКИ 2016, Т. 158, кн. 1 ISSN 1815-6126 (Print) С. 133–145 ISSN 2500-2171 (Online) УДК 8.82-3 СТАНОВЛЕНИЕ ЭПИЧЕСКОГО В "СЕВАСТОПОЛЬСКИХ РА...»

«Научно-методическое обеспечение медиаобразования Клавдия Васильевна Хомутова, Федеральный центр технического творчества учащихся, заведующая редакционно-издательским отделом, кандидат педагогических наук, Москва Аннотация: В статье актуализиру...»

«0 Акционерное общество "ОргСинтезРесурс"СТАНДАРТ ОРГАНИЗАЦИИ СТАНДАРТ ОРГАНИЗАЦИИ МАТЕРИАЛ ВЯЖУЩИЙ НА ОСНОВЕ ПОЛИУРЕТАНА ДЛЯ АВТОМОБИЛЬНЫХ ДОРОГ И ИСКУССТВЕННЫХ СООРУЖЕНИЙ Технические условия Издание официальное СТО 88902...»

«Містобудування та територіальне планування 341 УДК 658.511:69.057 Никифоров А.Л., к.т.н. Менейлюк И.А., Одесская государственная академия строительства и архитектуры, к.т.н. Ершов М.Н., Московский государственный строительный университет МНОГОК...»

«Вестник ТГАСУ № 4, 2010 АРХИТЕКТУРА И ГРАДОСТРОИТЕЛЬСТВО УДК 72.032 + 7.032.7 ПОЛЯКОВ ЕВГЕНИЙ НИКОЛАЕВИЧ, канд. архит., доцент, polyakov.en@yandex.ru Томский государственный архитектурно-строительный университет, 634003, г. Томск, пл. Соляная, 2 АРЕОСТИЛЬ – ЭТРУССКИЙ...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт природных ресурсов Направление подготовки (специальность) 21.03.01 "Нефтегазовое дело" П...»

«КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТЬ И ИННОВАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ГОСУДАРСТВ: АНАЛИЗ МЕЖДУНАРОДНЫХ РЕЙТИНГОВ И ИНДИКАТОРОВ Денисюк В.А. Центр исследований научно-технического потенциала и истории науки им. Г.М. Доброва НАН Украины Мировой опыт свидетельствует, ч...»

«Группа Сервисных Предприятий "МОРИНЖГЕОЛОГИЯ" Член Российского Союза Нефтегазостроителей АО "МОРИНЖГЕОЛОГИЯ" http://www.morinzhgeologia.ru/ Методика и технические средства инженерногеологических изысканий...»

«УДК. 621.039.51 Дружаев Андрей Александрович Интегрированные математические модели активных зон ядерных реакторов для контроля распределения энерговыделения в режиме реального времени Специальность 05.14.03 Яде...»

«RAUVISIO bRIllIAnt Технический справочник Настоящий технический справочник "RAUVISIO Авторские права на документацию защищены. brilliant" действителен с июля 2015 г. Соответствующие права сохраняютс...»

«Научно-производственное предприятие "ИНТЕРПРИБОР" ИНСТРУКЦИЯ по диагностике буронабивных свай прибором ПУЛЬСАР-2.2 и комплектом спецсредств (версия ДБС) Челябинск 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ 1 Назначение и состав. 3 2 Технические характеристики. 4 3 Устройство и прин...»

«УТВЕРЖДАЮ: Начальник службы автоматики и телемеханики _ А.С. Батьканов ""_2007 г.6.1. АППАРАТНО-ПРОГРАММНЫЙ КОМПЛЕКС ДИСПЕТЧЕРСКОГО КОНТРОЛЯ (АПК-ДК).1.НАЗНАЧЕНИЕ Аппаратно-программный комплекс диспетчерского контроля (АПК-Д...»

«СТАБИЛИЗАТОР СЕТЕВОГО НАПРЯЖЕНИЯ TEPLOCOM ST – 1300 исп.5 РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ ФИАШ.436218.041 РЭ Благодарим Вас за выбор нашего стабилизатора, который обеспечит Вам надежную защиту Ваших электроприборов. Настоящее руково...»

«Содержание 1 Технические требования 9 2 Требования безопасности и охраны окружающей среды 22 3 Правила приемки 22 4 Методы контроля и испытаний ограждений 23 5 Упаковка, маркировка, транспортирование и хранение 29 6 Гарантии изготовителя 29 7 Прило...»

«ВЕТЕРИНАРНЫЕ НАУКИ УДК 619:616 В.Д. Конвай, В.И. Зайнчковский, Д.В. Скачков, С.А. Оржеховский МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ У ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ КОРОВ Современное молочное скотоводство рентабельно лишь при надоях от одной коровы не менее 5 тысяч литров. Добиться такого резу...»

«Научнопроизводственное предприятие "ЭОС" Высоковольтные частотно-регулируемые электроприводы ПЧТЭ-ТВ Каталог ПЧТЭ-ТВ Устройства автоматического регулирования на основе преобразовательнотрансформаторного оборудования...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.