WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 

«ИНСТРУКЦИЯ по применению тест-системы «ЛПС» для выявления патогенных лептоспир методом полимеразной цепной реакции (организация-производитель – ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии ...»

ИНСТРУКЦИЯ

по применению тест-системы «ЛПС» для выявления патогенных лептоспир методом

полимеразной цепной реакции

(организация-производитель – ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва)

Тест-система «ЛПС» (test-system «LPS») для выявления 16S РНК патогенных

лептоспир методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в одном формате:

Формат FRT – для выявления 16S РНК патогенных лептоспир методом

полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

I.

Форматы и формы выпуска тест-системы:

Формат FRT Тест-система «ЛПС» формат FRT, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в 3 формах комплектации:

Форма 1 включает:

комплект реагентов «РИБО-преп» вариант 50 – комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала;

комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F – комплект реагентов для проведения реакции обратной транскрипции 16S РНК и амплификации участка кДНК патогенных геномовидов лептоспир с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Форма 2 включает:

комплект реагентов «РИБО-золь-С» вариант 50 – комплект реагентов для первого этапа выделения РНК из биологического материала;

комплект реагентов «РИБО-сорб» вариант 50 – комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала;

комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F – комплект реагентов для проведения реакции обратной транскрипции 16S РНК и амплификации участка кДНК патогенных геномовидов лептоспир с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Формат FRT Форма 3: Кат. №: VET-49-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 1 из 16

Форма 3 включает:

комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F – комплект реагентов для проведения реакции обратной транскрипции 16S РНК и амплификации участка кДНК патогенных геномовидов лептоспир с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Формы комплектации 1 и 2 предназначены для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию РНК из биологического материала, реакцию обратной транскрипции и амплификацию кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Форма комплектации 3 предназначена для проведения реакции обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции РНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

1.1 Комплект реагентов «РИБО-преп» вариант 50 состоит из следующих компонентов:

Раствор для л

–  –  –

При хранении раствора для лизиса, лизирующего раствора и раствора для отмывки 1 при температуре от 2 С до 8 С возможно образование осадка в виде кристаллов.

Формат FRT Форма 3: Кат. №: VET-49-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 2 из 16

К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:

2 пробирки, 1,6 см3 (мл) ОКО 5 пробирок по 0,03 см3 (мл) ПКО Leptospira-rec 5 пробирок по 0,12 см3 (мл) ВКО STI-87-rec Допускается другая фасовка, согласованная в установленном порядке.

Формы комплектации 1 и 2 предназначены для полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию РНК из биологического материала, проведение реакции обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Форма комплектации 3 предназначена для проведения реакции обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для полного анализа необходимо использовать комплекты реагентов «РИБО-сорб» и «РИБО-золь-С» или «РИБО-преп» для экстракции РНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Упаковка и маркировка.

На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке (флаконе), номера серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные застегивающиеся пакеты из полиэтилена. На каждый пакет наклеивают (или вкладывают) этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в комплект, количества пробирок каждого компонента, количества препарата в каждой пробирке (флаконе), номер серии комплекта, условия хранения, даты изготовления, срока годности.

Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы, перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения, обозначения ТУ/СТО и надпись «Для животных». В каждую упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.

Транспортирование и хранение.

Тест-систему транспортировать при температуре от 2 С до 8 С не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.

Комплекты реагентов «РИБО-золь-С», «РИБО-сорб», «РИБО-преп», «ПЦР-комплект»

(кроме ОТ-ПЦР-смеси-1-FRT ОТ-ПЦР-смеси-2-FEP/FRT, RT-G-mix-2, Leptospira, полимеразы (TaqF) и ТМ-Ревертазы (MMlv)) хранить при температуре от 2 С до 8 °С. RT-Gmix-2, ОТ-ПЦР-смесь-1-FRT Leptospira, ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT, полимеразу (TaqF) и ТМ-Ревертазу (MMlv) хранить при температуре от минус 24 °С до минус 16 °С. ОТ-ПЦРсмесь-1-FRT Leptospira хранить в защищенном от света месте.

Срок годности – 12 мес с даты изготовления.

II. ПРИНЦИП МЕТОДА Метод обнаружения pРНК патогенных лептоспир основан на выделении РНК из биологического материала, совместно с РНК экзогенного неконкурентного внутреннего контрольного образца (ВКО), проведении обратной транскрипции выделенной РНК, амплификации полученной кДНК и гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации в режиме «реального времени». Результат амплификации кДНК рРНК лептоспир регистрируется на канале JOE/Yellow/HEX, результат амплификации экзогенного ВКО регистрируется на канале флуоресценции FAM/Green. Использование экзогенного ВКО позволяет контролировать основные этапы ПЦР-анализа (выделение РНК и проведение амплификации кДНК).

–  –  –

Аналитическая специфичность Специфичность набора реагентов проверялась на следующих штаммах микроорганизмов: сапрофитный вид Leptospira biflexa, Treponema pallidum, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Mycoplasma hyopneumonia, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynovia;

Brucella suis; Brucella abortus, Brucella ovis, Brucella canis, Brucella melitensis, Chlamydia suis;

Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus, Chlamydophila felis; Haemophilus parasuis;

Lawsonia intracellularis; Actinobacillus pleuropneumoniae; Bordetella bronchiseptica; Pasterella multocida; Listeria monocytogenes; Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium; Escherichia coli; Campylobacter jejuni; Salmonella choleraesuis;

Staphylococcus aureus; Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis.

При проведении тестирования данной панели штаммов, а также образцов ДНК человека, свиньи, КРС, собаки, кошки, овцы неспецифических реакций выявлено не было.

IV. ПОРЯДОК ОТБОР И ПОДГОТОВКИ ПРОБ

Тест-система «ЛПС» предназначена для выявления 16S PНК патогенных геномовидов лептоспир в материале от павших животных (ткани мозга, легких, почек) и животных с острой формой инфекции (кровь) и при персистенции лептоспир в почках (моча) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Отбор материала для исследования При отборе материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо 7.1 соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

Материал от каждого животного отбирают отдельными инструментами.

7.2 Для исследования используют мочу, кровь, ткани мозга, легких, почек, культуры 7.3 бактерий.

Подготовка исследуемого материала.

Взятие цельной периферической крови проводится утром натощак в пробирку с 6 % 8.1 раствором ЭДТА из расчета 1:20. Закрытую пробирку с цельной периферической кровью несколько раз переворачивают. Для отбора плазмы пробирку с кровью центрифугируют в течение 10 мин при 1000 g (если кровь стояла при температуре от 2 С до 8 С более 1 ч после ее забора, то пробирку следует аккуратно несколько раз перевернуть для равномерного перемешивания крови). Затем отбирают две пробирки по 1 мл плазмы и центрифугируют ее при 11500 g в течение 10 мин для концентрирования бактериальных клеток. После этого 900 мкл надосадочной плазмы удаляют наконечником с фильтром в емкость с дезинфицирующим раствором, а осадок и 100 мкл надосадочной жидкости исследуются на наличие 16S РНК лептоспир. Аналогичным образом приготовленный второй осадок хранится при температуре не выше минус 16 °С для повторной экстракции в случае нарушения какого-либо из технологических процессов. Допускается хранение только осадка плазмы при температуре не выше минус 16 С в течение 1 недели, длительное хранение – при температуре не выше минус 68 °С.

Для исследования моча собирается в стерильную посуду. Если нет возможности 8.2 Формат FRT Форма 3: Кат. №: VET-49-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 4 из 16 исследовать материал в течение 24 ч после взятия, моча переносится в центрифужную пробирку на 30 мл или «Эппендорф», затем в нее вносят глицерин, 10 % от объема пробы, перемешивают для равномерного распределения глицерина и замораживают при температуре не выше минус 16 °С для хранения в течение 1 нед или при температуре не выше минус 68 °С в течение более длительного времени.

При наличии центрифуги с охлаждением до 4 °С для пробирок объемом 30 мл и ускорением 9-10 тыс g используется следующий алгоритм пробоподготовки.

Пробу центрифугируют при 9-10 тыс g в течение 10 мин, затем надосадочную жидкость переносят в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в пробирке осадок и 1 мл надосадочной жидкости, после чего осадок ресуспендируют в оставшемся 1 мл надосадочной жидкости и переносят в отдельную пробирку. После чего снова концентрируют пробу при 11500 g в течение 10 мин. 900 мкл надосадочной жидкости переносят в емкость с дезинфицирующим раствором, а осадок и 100 мкл надосадочной жидкости используют для экстракции РНК. В случае наличия большого количества солей или слизи, для экстракции РНК в отдельную пробирку переносят 100 мкл надосадочной жидкости и верхний слой клеток, аккуратно снятый с осадка солей.

При отсутствии центрифуги для пробирок объемом 30 мл и ускорением 9-10 тыс g, проводят концентрирование бактерий только из 1 мл мочи как описано выше, используя пробирки на 1,5 мл и микроцентрифугу для пробирок типа «Эппендорф».

Внутренние органы гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых 8.3 ступок и пестиков, затем готовят 10 % суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Для экстракции РНК берут 30 мкл суспензии.

Культуры бактерий развести в 1000 раз стерильным физиологическим раствором или 8.4 фосфатным буфером. Для экстракции РНК использовать 100 мкл полученного разведения.

Допускается хранение клинического материала (кровь, моча) до проведения 8.5 исследования в течение суток при температуре от 2 С до 8 °С. Секционный материал (ткани мозга, легких, почек) хранить 1 неделю при температуре не выше минус 16 °С, длительно – при температуре не выше минус 68 °С.

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-АНАЛИЗА

V.

ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах).

Для работы требуются следующие материалы и оборудование.

ЗОНА 1 – Для экстракции РНК из исследуемого материала:

9.1 Ламинарный бокс (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия, класс биологической безопасности II тип А).

Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).

Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия).

Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс g (например, MiniSpin, Eppendorf, Германия).

Центрифуга/вортекс для пробирок типа «Эппендорф» (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).

Набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки на 1,5 мл (например, Axygen, США).

Штативы для пробирок на 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, Axygen, США).

Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, Axygen, США).

Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например, Axygen, США).

Формат FRT Форма 3: Кат. №: VET-49-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 5 из 16 Холодильник от 2 С до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 С до минус 16 С.

Отдельный халат и одноразовые перчатки.

Емкость с дезинфицирующим раствором.

ЗОНА 2 – Для реакций обратной транскрипции и амплификации, а также 9.2 гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации:

Амплификатор (например, «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research», Австралия);

Rotor-Gene Q («QIAGEN GmbH», Германия), «iCycler iQ5» («Bio-Rad», США) или эквивалентный).

ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).

Вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).

Набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл (например, Axygen, США).

Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 200 мкл (например, Axygen, США).

Штативы для наконечников (например, Axygen, США) и пробирок объемом 0,2 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).

Холодильник от 2 С до 8 °С.

Отдельный халат и одноразовые перчатки.

Емкость с дезинфицирующим раствором.

Порядок работы.

10.1 ЭТАП 1 (зона 1). Экстракция РНК из исследуемого материала:

Для экстракции pРНК лептоспир из различных биологических объектов необходимо использовать следующие комплекты реагентов производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии

Роспотребнадзора:

«РИБО-преп» – экстракция РНК из крови, осадков мочи, содержащих только эпителиальные клетки и не содержащих соли, культур бактерий;

«РИБО-золь-С» – экстракция РНК на первом этапе экстракции из крови, суспензий тканей внутренних органов, осадков мочи (в том числе содержащих соли), культур бактерий. Второй этап экстракции РНК проводится с использованием комплекта «РИБОсорб»;

А. Экстракция РНК при помощи комплекта реагентов «РИБО-преп».

Раствор для лизиса (если он хранился при температуре от 2 С до 8 °С) прогреть при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов.

В случае экстракции РНК из гомогенатов тканей отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл с плотно закрывающимися крышками (включая отрицательный и положительный контроли экстракции). Внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО STI-87-rec. Добавить в пробирки по 300 мкл раствора для лизиса.

Промаркировать пробирки.

В пробирки с раствором для лизиса и ВКО STI-87-rec внести по 30 мкл исследуемых суспензий.

При экстракции из осадков клеток после концентрирования лептоспир непосредственно в исследуемые пробирки с осадками необходимо внести 300 мкл раствора для лизиса и 10 мкл ВКО STI-87-rec.

В пробирку отрицательного контроля (В–) экстракции вносят только 10 мкл ВКО STIrec и 300 мкл раствора для лизиса.

В пробирку положительного контроля (ПК) экстракции внести 300 мкл раствора для лизиса, затем добавить 90 мкл ОКО, 10 мкл ВКО STI-87-rec и 10 мкл ПКО Leptospira-rec.

Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при 65 С в Формат FRT Форма 3: Кат. №: VET-49-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 6 из 16 термостате.

Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешать на вортексе.

Процентрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при 13 тыс об/мин.

Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести процедуру одновременно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив.

Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 2 мин на микроцентрифуге.

Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.

Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 2 мин на микроцентрифуге.

Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.

Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты).

Добавить в пробирки по 40 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

Процентрифугировать пробирки при 13 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенные РНК и ДНК. Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции и ПЦР.

Б. Экстракция РНК при помощи комплектов реагентов «РИБО-золь-С» и «РИБОсорб».

I этап.

В пробирки с исследуемыми осадками крови или мочи или с тканевым гомогенатом внести по 300 мкл раствора D, затем добавить 10 мкл ВКО STI-87-rec. В пробирку отрицательного контроля экстракции (В–) внести 300 мкл раствора D, затем добавить 10 мкл ВКО STI-87-rec и 100 мкл ОКО. В пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 300 мкл раствора D, затем добавить 90 мкл ОКО, 10 мкл ВКО STI-87-rec и 10 мкл ПКО Leptospira-rec. После чего пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть при температуре 56 °С в течение 5 мин, несколько раз перемешивая. После этого пробы необходимо центрифугировать в течение 5 с на вортексе для удаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки. В случае исследования суспензий тканей органов можно на первом этапе в пустые пробирки внести 300 мкл раствора D, 10 мкл ВКО STI-87-rec и затем по 30 мкл исследуемой пробы.

Добавить к образцам, лизированным в растворе D, 30 мкл раствора Е, перемешать на вортексе и центрифугировать 5 с для сбрасывания капель с крышки пробирки.

В пробирки добавить 300 мкл раствора А, перемешать на вортексе и центрифугировать 5 с на вортексе для сбрасывания капель с крышки пробирки.

В пробирки добавить 100 мкл раствора В, перемешать на вортексе в течение 1-2 мин (раствор должен стать молочно-белым), затем поместить пробы на ледяную баню (при температуре от 0 до 4 С) на 10 мин. После этого центрифугировать пробирки в течение 10 мин при 10 тыс g.

В новые пробирки объемом 1,5 мл внести по 400 мкл лизирующего раствора и промаркировать соответственно номерам проб.

После центрифугирования раствор должен разделиться на 2 фазы: нижнюю (фенольную), содержащую белки и ДНК, и верхнюю (водную), содержащую РНК.

Необходимо аккуратно отобрать верхнюю фазу (400 мкл при экстракции РНК из осадков Формат FRT Форма 3: Кат. №: VET-49-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 7 из 16 мочи и гомогенатов внутренних органов, 200 мкл – из осадков крови, 450 мкл при экстракции РНК из ОКО и ПКО), не захватывая нижний слой, и перенести ее в пробирку с лизирующим раствором. Тщательно перемешать смесь.

II этап.

Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл сорбента. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 1 мин, еще раз перемешать и оставить на 5 мин.

Центрифугировать пробирки для осаждения сорбента при 7 тыс об/мин в течение 30 с на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 1. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 30 с при 7 тыс об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. Процентрифугировать 45 с при 9 тыс об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.

Повторить отмывку раствором для отмывки 3.

Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 4. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе, процентрифугировать 1 мин при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге. Полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой.

Поместить пробирки в термостат при температуре 56 С на 10 мин для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

В пробирки добавить по 40 мкл РНК-буфера, используя свободный от РНКаз наконечник с аэрозольным барьером. Перемешать содержимое пробирок на вортексе.

Поместить в термостат при температуре 56 С на 5 мин (встряхивая пробы на вортексе каждую минуту). Перемешать на вортексе и процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги (13 тыс об/мин) в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную РНК. Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции и ПЦР.

10.2 ЭТАП 2 (зона 2). Проведение реакции обратной транскрипции, амплификации и детекции продуктов амплификации.

Общий объем реакции – 25 мкл, объем РНК-пробы – 10 мкл.

ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку RNase-free, DNase-free.

Порядок работы:

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Поставить в штатив необходимое количество пробирок для амплификации РНК исследуемых и контрольных проб. Тип пробирок зависит от используемого прибора. Для N исследуемых образцов, с учетом отрицательного и положительного контролей прохождения реакции амплификации ДНК необходимо взять (N+2) пробирок.

Приготовить реакционную смесь на необходимое количество реакций – смешать в отдельной пробирке ОТ-ПЦР-смесь-1-FRT Leptospira, ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT, полимеразу (TaqF), TM-Ревертазу (MMlv) и RT-G-mix-2 из расчета на каждую реакцию:

10 мкл ОТ-ПЦР-смеси-1-FRT Leptospira 5 мкл ОТ-ПЦР-смеси-2-FEP/FRT 0,5 мкл полимеразы (TaqF) 0,25 мкл TM-Ревертазы (MMlv) Формат FRT Форма 3: Кат. №: VET-49-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 8 из 16 0,25 мкл RT-G-mix-2 Внести в пробирки по 15 мкл готовой реакционной смеси. Неиспользованные остатки реакционной смеси выбросить.

Используя наконечник с аэрозольным барьером, добавить 10 мкл проб РНК исследуемых образцов и контролей этапа экстракции в пробирку с реакционной смесью.

Осторожно перемешать пипетированием. (При добавлении РНК-проб необходимо избегать попадания сорбента в реакционную смесь для ОТ-ПЦР).

Поставить контрольные реакции амплификации.

А) отрицательный контроль (К-) – внести в пробирку 10 мкл РНК-элюента.

Б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО кДНК Leptospira.

ВНИМАНИЕ! Пробы амплифицировать сразу после соединения реакционной смеси, РНК-пробы и контролей! Время внесения проб в реакционную смесь и запуска реакции на приборе не должно превышать 10-15 мин.

Б. Проведение амплификации.

Запрограммируйте прибор для выполнения соответствующей программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала согласно описанию для данного прибора (см. приложения к инструкции для используемого прибора).

Анализ результатов осуществляется автоматически в программном обеспечении, соответствующем используемому оборудованию.

МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

VI.

Необходимо строго соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы здравоохранения СССР», Москва, 1981 г.

Выделение РНК из клинического и биологического материла проводится в ламинарных шкафах с системой обеззараживающей фильтрации воздуха.

Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером.

Одноразовую пластиковую посуду необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания биоматериалов (например, 0,2 % раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты).

Посуда (ступки и пестики), использованная для гомогенизации продуктов, выдерживается в растворе дезинфицирующего средства (например, 5 % растворе хлорамина Б) в течение одного часа или в растворе хромовой смеси в течение 30 минут, моется водопроводной водой с поверхностно-активными моющими средствами и после отмывания в проточной и деионизованной воде высушивается в сухожаровом шкафу в течение 4 часов при температуре 180 С. Металлические инструменты (скальпели, ножницы, пинцеты) фламбируют, т.е. обрабатывают спиртом и обжигают в пламени горелки.

Анализ проводится в два этапа в двух отдельных помещениях (зонах), согласно МСХиП РФ 27.01.1997 г. № 13-7-2/840 «Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующий метод полимеразной цепной реакции. Основные положения», утвержденные Департаментом ветеринарии.

Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое.

Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо облучать ультрафиолетовым светом.

Тест-систему хранить в местах, не доступных для детей.

Формат FRT Форма 3: Кат. №: VET-49-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 9 из 16 Инструкция разработана ФГБУ ВГНКИ (г. Москва) совместно с ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а).

–  –  –

Формат FRT Форма 3: Кат. №: VET-49-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 11 из 16 Напротив всех исследуемых образцов установить тип Unknown/Образец, положительных контролей – тип Positive control/Положительный контроль, для отрицательного контроля экстракции – тип Negative control/Отрицательный контроль, отрицательного контроля ОТПЦР – тип NTC/ОТР. (ПФ). Для ячеек, соответствующих пустым пробиркам, установить тип None/ Пусто.

Анализ результатов.

Анализ результатов амплификации Leptospira (канал JOE):

Активировать нажатием в меню кнопки Analysis/Анализ, выбрать режим анализа Quantitation/Количественный, активировать кнопку Cycling A. JOE/Cycling A. Yellow, Show/Показать.

Отменить автоматический выбор уровня пороговой линии Threshold/Порог.

В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны быть активированы кнопки Dynamic tube/Динамич.фон и Slope Correct/Коррект.уклона.

В меню CT Calculation/Вычисление CT (в правой части окна) выставить уровень пороговой линии Threshold/Порог = 0.04 и установить значение More settings/Удаление выбросов – 10%.

В таблице результатов (окно Quant. Results/Количественные Результаты) появятся значения Ct.

Значение Ct для положительного контроля экстракции (ПК) – ПKO Leptospira-rec – не должно превышать значения порогового цикла 26.

Значение Ct для положительного контроля (К+) ОТ-ПЦР – ПKO кДНК Leptospira – не должно превышать значения порогового цикла 25.

В отрицательном контроле экстракции (В–) – ОКО – не должно быть каких-либо значений Ct.

В отрицательном контроле (К-) ОТ-ПЦР – РНК-элюент – не должно быть каких-либо значений Ct.

Пробы, в которых появились значения Ct, не превышающие значения порогового цикла 32, считаются положительными. Если для пробы получено значение Ct более 32, то результат считается сомнительным, необходимо провести дополнительное исследование данного образца РНК в двух повторах.

Анализ результатов амплификации BKO (канал FAM):

Активировать нажатием в меню кнопки Analysis/Анализ, выбрать режим анализа Quantitation/Количественный, активировать кнопку Cycling A. FAM/Cycling A. Green, Show/Показать.

Отменить автоматический выбор уровня пороговой линии Threshold/Порог.

В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны быть активированы кнопки Dynamic tube/Динамич.фон и Slope Correct/Коррект.уклона.

В меню CT Calculation/Вычисление CT (в правой части окна) выставить уровень пороговой линии Threshold/Порог = 0.03 и установить значение More settings/Удаление выбросов – 10%.

В таблице результатов (окно Quant. Results/Количественные Результаты) должны появиться значения Ct для ВКО STI-87-rec в каждом исследуемом образце, положительном (ПК) и отрицательном (В–) контролях экстракции.

В отрицательном контроле (К-) – РНК-элюент и положительном контроле (К+) – ПКО кДНК Leptospira ОТ-ПЦР не должно быть каких-либо значений Ct.

В исследуемых образцах значения Ct не должны превышать значения порогового цикла 25 для осадков крови и 27 для гомогенатов тканей. Если значение Ct в пробе превышает значения порогового цикла, то в случае отрицательного Ct по каналу JOE в этом образце, результат анализа считается невалидным, необходимо провести повторный ПЦР-анализ данного исследуемого образца, начиная с этапа экстракции.

Возможные ошибки.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля Формат FRT Форма 3: Кат. №: VET-49-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 12 из 16 экстракции (В–) по каналу JOE и/или для отрицательного контроля (К-) ОТ-ПЦР по каналам FAM, JOE свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем образцам считаются недействительными.

Необходимо повторить анализ всех образцов, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Если значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля экстракции (В–) по каналу FAM и/или положительного контроля экстракции (ПК) по каналам FAM, JOE отсутствуют – результаты анализа по всем образцам считаются недействительными.

Необходимо повторить анализ всех образцов с этапа экстракции.

Если значение Ct в таблице результатов для положительного контроля (К+) ОТ-ПЦР по каналу JOE отсутствует – результаты анализа по всем образцам считаются недействительными. Необходимо повторить анализ всех образцов с этапа ОТ-ПЦР.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ

ПОМОЩИ ПРИБОРА «iCycler iQ5» («Bio-Rad», США) Программирование амплификатора.

Включить прибор и оптический модуль за 20-30 мин до проведения реакции.

Задать программу амплификации (Protocol) (см. табл. 2).

–  –  –

Формат FRT Форма 3: Кат. №: VET-49-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 13 из 16 В отрицательном контроле (К-) ОТ-ПЦР – РНК-элюент – не должно быть каких-либо значений Ct.

Пробы, в которых появились значения Ct, не превышающие значения порогового цикла 32, считаются положительными. Если для пробы получено значение Ct более 32, то результат считается сомнительным, необходимо провести дополнительное исследование данного образца РНК в двух повторах.

Анализ результатов амплификации BKO (канал FAM):

Выбрать Base line в Crossing Threshold User Defined 25,0.

В отрицательном (К-) – РНК-элюент и положительном (К+) – ПКО кДНК Leptospira контролях ОТ-ПЦР не должно быть каких-либо значений Ct.

В исследуемых образцах значения Ct не должны превышать значения порогового цикла 27 для осадков крови и 29 для гомогенатов тканей и осадков мочи. Если значение Ct в пробе превышает это значение порогового цикла, то в случае отрицательного Ct по каналу HEX в этом образце результат анализа считается невалидным, необходимо провести повторный ПЦР-анализ данного исследуемого образца, начиная с этапа экстракции.

Возможные ошибки.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля экстракции (В–) по каналу HEX и/или для отрицательного контроля (К–) ОТ-ПЦР по каналам FAM, HEX свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов.

В этом случае результаты анализа по всем образцам считаются недействительными.

Необходимо повторить анализ всех образцов, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Если значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля экстракции (В–) по каналу FAM и/или положительного контроля экстракции (ПК) по каналам FAM, HEX отсутствуют, результаты анализа по всем образцам считаются недействительными.

Необходимо повторить анализ всех образцов с этапа экстракции.

Если значение Ct в таблице результатов для положительного контроля (К+) ОТ-ПЦР по каналу HEX отсутствует, результаты анализа по всем образцам считаются недействительными. Необходимо повторить анализ всех образцов с этапа ОТ-ПЦР.

–  –  –



Похожие работы:

«I. ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Программа профессиональной подготовки водителей транспортных средств категории A разработана в соответствии с требованиями Федерального закона от 10 декабря 1995 г. N 196-ФЗ О безопасности дорожного движения (Собрание законодательства Росси...»

«1 "В горах Адыгеи". Бормотов И.В. Оглавление.. 1 Часть первая. Жемчужины Адыгеи.1. Алмазные россыпи снежной ночи. 3 2. Пещера Джоласа.. 6 3. Там где начинается Фарс. 9 4. Водопады Кутанки.. 12 5. Манькин шум.. 16 2. Азиш-Тау осенью.. 19 3. Скала Колокольня.. 22 4. Водопады урочища Сибирь. 26 5. Мезмай.. 29 6. Целебный во...»

«с ЪЧ. ъ & 'е Ч з е. ) ело РА И С д С А.Р Щ 4-039910 ВОЗВРАТИТЕ КНИГУ НЕ ПОЗЖЕ обозначенного здесь срока М т 3 3835 Т 5000 1989г ОБ Г '.. м Б Е С П аа I г1ЫЙ Лс паратъ юмах-халсйг ЭКЗЕМ ПЛЯР Халалпа на калап. Эта книга посвящается всем, кто сказкой просвещается. РАИС РАИСД САРЩ Юм...»

«ГРУППОВЫЕ ПРОГРАММЫ ПО ШВЕЙЦАРИИ Заезды по пятницам Солнечное лето Завтра улечу в солнечное лето. Мне все твердят из года в год, Что я не ведаю забот, Что надо Давно серьёзней стать Только никому я не...»

«КАРТОТЕКА "ИГРЫ НА РАЗВИТИЕ ПОЗНАВАТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ" ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Для успешного приобретения знаний, умений и навыков, предусматривающих раскрытие потенциальных возможностей каждого воспитанника, направлен...»

«Изв. вузов "ПНД", т. 17, № 3, 2009 УДК 537.862 ТЕОРИЯ ВОЗБУЖДЕНИЯ ВОЛНОВОДОВ В.А. Солнцев Изложена теория возбуждения волноводов заданными сторонними источниками, основанная на разложениях возбуждаемого э...»

«тел. 0 (800) 502 217 конфигурация по расчету квартплаты в Украине 01 марта 2015 www.kvarta-c.ru/ua слайд 1 Для кого? тел. (048) 734 03 25 конфигурация предназначена для следующих организаций: ОСМД (ОСББ) ЖСК, гаражные и дачные кооперати...»

«Содержание Введение Предварительные условия Требования Используемые компоненты Условные обозначения Не может вставить IP-телефоны Использование BAT Проблема Решение После Обновления Cisco Unified CallManager Пользователь не Может Импортировать Телефоны с помощью BAT Проблема Решение Задачи группового администрирования остаю...»

«0904017 ГПЕГПГПЕР г Experts in Thermostatics Общая программа оборудования для термостатирования •ЯШ ;^ai иня Оборудование для Более 60-ти вариантов исполнения для 40 наивысших требований термостатирования С02 инкубаторы, вакуумные шкафы, охлаждающие инкуба Спе...»









 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.