WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 

«доктор мед.наук Мороков В.А., Pay И.В. БЫСТРЫЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ИММУННЫХ (IgG) АНТИТЕЛ СИСТЕМЫ АВО И ЕГО МИКРОМОДИФИКАЦИЯ В ...»

доктор мед.наук Мороков В.А., Pay И.В.

БЫСТРЫЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ИММУННЫХ (IgG) АНТИТЕЛ СИСТЕМЫ АВО И ЕГО

МИКРОМОДИФИКАЦИЯ В ПОЛИСТИРОЛОВЫХ

ПЛАНШЕТАХ

Коми филиал КГМА, Сыктывкар

Проблема определения иммунных антител системы АВО остается актуальной в практике

иммуногематологического обследования беременных и родильниц. Это обусловлено увеличением в

последние годы частоты развития гемолитического заболевания новорожденного (ГБН), обусловленного анти-А или анти-В антителами класса IgG [1]. Последние обладают способностью преодолевать плаценту, связывать комплемент и вызывать гемолиз эритроцитов плода in vivo [3]. В наибольшей степени образованию таких антител подвержены женщины с группой крови 0(1)[1-3].

Своеобразие проблемы состоит в том, что иммунные антитела АВО во всех случаях приходится дифференцировать с естественными изогемагглютининами. С этой целью предложено несколько методов их определения. Один из них основан на параллельном определении титров в солевой и белковой средах при различных температурах [1]. Другая техника основана на предварительной обработке исследуемых сывороток путем прогревания при 70°С с целью разрушения естественных изогемагглютининов с последующим ее исследованием в непрямой реакции Кумбса и солевой среде [2]. Еще один метод, разработанный Матвеевой М.А. и соавт., в большей степени приближается к существующим мировым стандартам и основан на предварительной обработке сывороток унитиолом, донатором сульфгидрильных групп [1], Тем не менее, наш опыт показал, что ни одна из названных выше техник не является достаточно надежной для рутинного применения.

Так, при использовании метода параллельного титрования интерпретация результатов часто затруднительна из- за незначительных различий в титрах несмотря на наличие, в ряде случаев, явных симптомов гемолитического заболевания (ГБН) у новорожденных обследуемых родильниц.

Техника, основанная на предварительном разрушении естественных антител путем прогревания предполагает се разведение перед прогреванием в 4 раза. В результате такой обработки во многих случаях происходит нейтрализация иммунных антител анти-А и анти-В. На это со всей очевидностью указывает низкая частота обнаружения иммунных антител описанным методом в сравнении с другими. Кроме того, метод является во многом эмпирическим, поскольку для дифференциации антител IgM и IgG путем прогревания предварительно разведенной сыворотки нет достаточно убедительного теоретического обоснования с позиций иммунохимии.

Исследования 132 образцов сывороток с использованием редуцента унитиола, проведенные нами параллельно с использованием техники с другим донатором сульфгидрила, 2- меркаптоэтанолом (2МЕ) показали большой процент несовпадения результатов. Техника с унитиолом демонстрировала присутствие иммунных антител в то время как в методе с 2МЕ этого не наблюдалось. Математический анализ реакций редуцированных сывороток путем составления корреляционной решетки "2 * Т показал недопустимо низкий коэффициент корреляции, составивший всего 0,45. Наконец, раствор унитиола не обладал способностью редуцировать моноклональные антитела (МКА) IgM анти-А и анти-В (тест-система "Цоликлон"), что со всей очевидностью свидетельствовало о его непригодности для редуцирования IgM.

Вероятно, это обусловлено низкой активностью двух SH- группировок унитиола в отношении их способности к разрыву дисульфидных мостиков внутри молекул IgM.

Последние не распадаются на мономеры и, как следствие, сохраняют свою активность в серологических тестах in vitro. Таким образом, антитела системы АВО, устойчивые к действию унитиола, помимо IgG фракции могут содержать также и IgM. Унитиолоустойчивые АВО-антитела выявляются с высокой частотой даже среди здоровых доноров (20,4 - 76,6% среди мужчин, 31,2 - 81,4% среди женщин) [2]. Однако известно, что преодолеть плацентарный барьер и обусловить ГБН способны только IgG, активные при 37°С [4].

Таким образом, надежные методы дифференцирования естественных и иммунных антител системы АВО в нашей стран.: ке разработаны. Это побудило нас остановить свой выбор на технике с использованием 2МЕ, широко используемой за рубежом для дифференциации IgM от IgG в различных иммунологических тестах in vitro [4]. Далее приводим подробно описание применяемой нами техники и ее ускоренной микромодификации.

Техника теста

1.В сухой чистой пробирке смешивают равные объемы (не менее 0,5 мл) испытуемой сыворотки и 0,2М рабочего раствора 2МЕ. Рабочий раствор готовят путем смешивания 1,49 мл 2- меркаптоэтанола (жидкость с крайне неприятным запахом) и 100 мл изотонического раствора натрия хлорида.

2.Пробу инкубируют в течение 1 часа в термостате или на водяной бане при 37°С.

3.Сыворотку, бывшую в контакте с 2МЕ, испытывают в прямых агглютинационных тестах с эритроцитами 0(1), А(П) и В(Ш) групп. Мы делаем это в методе "immediate spin" следующим образом. В отдельных пробирках смешивают по 100 мкл сыворотки и 50 мкл 1% взвеси отмытых эритроцитов, далее все пробы центрифугируют при 1000 g в течение 15 секунд. Осторожно встряхивая пробирки, добиваются полного отделения осадка эритроцитов, учитывают результаты. При положительном результате наблюдаются агглютинаты различной величины в виде хлопьев или комочков на фоне почти или совсем осветленной жидкости. При отрицательном результате агглютинаты отсутствуют, жидкость на дне пробирки окрашена равномерно в розовый цвет.

Интерпретация результатов

1.Сыворотки, утратившие способность агглютинировать эритроциты групп А(И) и/или В(Ш) в результате инкубации с раствором 2МЕ, не содержат иммунных (IgG) антител против указанных антигенов.

2.Результат с эритроцитами группы 0(1) должен быть всегда отрицательным.

2.Сыворотки, инкубированные с 2МЕ, и сохранившие способность реагировать с эритроцитами А(И) и/или В(Ш) групп, содержат иммунные антитела класса IgG к соответствующим антигенам.

Для определения активности (титра) выявленных иммунных антител готовят кратные разведения редуцированной сыворотки, каждое из них далее испытывают с соответствующими эритроцитами как описано выше. За титр антител принимают величину, обратную наибольшему разведению, в котором наблюдалась отчетливо различимая агглютинация. Исследования тех же сывороток с применением антиглобулиновой техники (непрямая проба Кумбса) показали, что тигры при ее использовании были на 2-3 ступени разведения выше в сравнении с прямыми агглютинационными реакциями, техника которых описана выше.

Мы считаем, что при определении иммунных антител системы АВО нет особой необходимости в исследовании сывороток, обработанных 2МЕ, в непрямой реакции Кумбса. Это обусловлено чрезвычайно высокой плотностью А- и В- детерминант на эритроцитах. По этой причине анти- А и анти-В IgG в полной мере проявляют свос действие уже в прямых агглютинационных тестах. Известно, что на одном эритроците лиц групп А(И), В(Ш), AB(IV) присутствует от 700 тыс. до 1 млн.200 тыс. А- и/или В-эпитопов [4].

Исследования, проведенные с IgM МКА анти- А и анти-В показали, что контакт с 2МЕ в описанных выше условиях приводит к их полной нейтрализации. Кроме того, как уже указано выше, антитела анти-А и анти-В, выявленные в обработанных сыворотках, во всех случаях реагировали (часто в очень больших разведениях) в непрямой реакции Кумбса. Это со всей очевидностью указывало на их IgG природу. Таким образом, метод оказался специфичным и полностью пригодным для практического использования.

При проведении массовых исследований и выявлении иммунных анти-А и/или анти-В антител с большой частотой могут возникнуть трудности, связанные с необходимостью определения антител и их титра у многих лиц. При этом возникает необходимость в использовании большого количества стеклянной лабораторной посуды, приготовление разведений для титрования большого количества сывороток является трудоемкой процедурой. Это создает большие неудобства в практической работе.

Кроме того, этап инкубации с 2МЕ в течение 1 часа не позволяет быстро выполненить исследование.

Таким образом, оказалось необходимым разработать ускоренный вариант теста в такой модификации, которая не требовала бы использования больших количеств стеклянной лабораторной посуды.

Проведенные нами испытания показали, что полное устранение действия IgM антител анти-А и анти-В сывороток происходит уже в течение 5-7 минут если пробы инкубируются при 45-46°С.

Инкубация при более высоких температурах или использование более концентрированных растворов 2МЕ оказалось неприемлемым, поскольку приводило к образованию геля. Кроме того, мы адаптировали гест для выполнения в 96-луночных палистироловых планшетах с U-образными лунками. Для этого необходимо располагать лабораторной центрифугой для указанных планшет. Мы использовали центрифугу марки ОПН-3, адаптированную для планшет.

Таким образом, модифицированная нами техника определения иммунных антител системы АВО выглядит следующим образом.

1.В пробирках смешивают равные объемы исследуемой сыворотки и 0,2М раствора 2МЕ, пробы инкубируют в течение 7 минут на водяной бане при 46°С.

2.В лунках 96-луночных круглодонных полистироловых планшет к 50 мкл сыворотки, бывшей в контакте с 2МЕ добавляют по 25 мкл 1% йзвеси эритроцитов групп 0(1), А(Н) и В(Ш), перемешивают содержимое лунок путем встряхивания планшеты. Затем планшеты центрифугируют в течение 1 минуты при 1000 об/ мин., встряхивают до полного рссуспендирования осадка эритроцитов и учитывают результаты по наличию или отсутствию агглютинации. В качестве отрицательных контролей служат все пробы с эритроцитами группы 0(1).

Титрование сывороток проводится в лунках планшет, для приготовления кратных разведений в объемах 50 мкл каждое используется 8-канальный пипеточный дозатор производства "Ленпипег' или "Biohit'. Затем к последним добавляют по 25 мкл 1% взвеси эритроцитов, смешивают встряхиванием, планшеты центрифугируем и учитывают результаты как описано выше. За титр принимается величину, обратную наибольшему разведению, в котором наблюдается отчетливо различимая агглютинация.

Примечания

1.Более длительная инкубация может привести к формированию геля.

2.Использование более насыщенных взвесей 2S эритроцитов может затруднить интерпретацию полученных результатов.

Наши наблюдения показали, что микровариант теста в планшетах является менее трудоемким в исполнении, более экономичным, требует минимальных количеств исследуемого материала и при этом не уступает по своей чувствительности варианту теста в пробирках. При параллельном выполнении тестов во всех случаях получены совпадающие результаты, Его применение резко сокращает необходимость в использовании стеклянных пробирок.

Кроме исследования сывороток, мы с успехом использовали описанные выше техники выявления иммунных антител АВО для определения их в молозиве. По нашим данным, в отличие от антител системы Rh, которые редко обнаруживаются в грудном молоке у сенсибилизированных родильниц, титры иммунных анти-А и/или анти-В антител в молозиве в первые дни после родов часто превышают таковые в сыворотке крови на 2-3 ступени разведения.

Таким образом, разработанный нами и описанный выше ускоренный вариант определения иммунных антител системы АВО с 2МЕ в планшетах может с успехом использоваться как скрининговый тест для массового обследования беременных. рожениц. родильниц в родовспомогательных учреждениях.

ЛИТЕРАТУРА

1.Матвеева М.А.. Минеева Н.В., Климова К.Н., Волкова О.А. //Гематол. и трансфузиол. - 1989. - №10.

С.42-44.

2.Меркулова Н.Н. Распространенность, физиологические и иммуносерологические особенности естественных и иммунных групповых антител системы.АВО у жителей Среднего Приобъя. Авторсф.

Дисс..канд биол. наук. М. Тюмень, 1999.

3.Умнова М.А.. Зотиков Е.А., Скачилова Н.Н., Лазаренко Ю.П. Изоиммунология и вопросы клиники и лечения гемотрансфузионных осложнений. М., 1979.

4.Issitt P.D. Applied Blood Group Serology. 3-d ed. Montgomery ScPubl., Miami,

Похожие работы:

«ЗДАНИЕ ЛИЦЕЯ Лицейские лекции (По записям А. М. Горчакова) I Одним из интереснейших явлений общественной жизни России начала XIX в. является царскосельский лицей, в котором учился А. С. Пушкин. Заведение это, задуманное правительством, как школа подготовки "юношества особ...»

«УДК 661.961.1 В.Б. ТРОШЕНЬКИН, канд. техн. наук, ИПМаш НАНУ, Харьков, Н.Н. ЗИПУННИКОВ, канд. техн. наук, НТУ "ХПИ", Б.А. ТРОШЕНЬКИН, докт. техн. наук, ИПМаш НАНУ, Харьков СРАВНЕНИЕ ЗНАЧЕНИЙ ЭЛЕКТРОДНЫХ ПОТЕНЦИАЛОВ ПРИ ВЫТЕСНЕНИИ ВОДОРОДА ИЗ ВОДЫ АЛЮМИНИЕВЫМИ И...»

«Т.В. Касаева К вопросу о проблеме воспроизводства человеческого капитала Человеческий капитал, как и другие виды капитала, подвержен износу со временем. Износ человеческого капитала связан с возникающи...»

«ВОССТАНОВЛЕНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЙ НЕЛИНЕЙНЫМИ ФИЛЬТРАМИ, ПОЛУЧЕННЫМИ ИДЕНТИФИКАЦИЕЙ ЛИНЕЙНОЙ ПО ПАРАМЕТРАМ МОДЕЛИ В.А. Фурсов, Д.А. Елкин Самарский государственный аэрокосмический университет имени академика С.П. Кор...»

«Взаимозаменяемость лекарственных средств. Особая группа лекарственных препаратов биоаналоги Проценко Марина Валерьевна Большинство биопрепаратов, формирующих рынок, потеряют патентную защиту к 2015 году Мировые продажи биопрепаратов US$ billion Ключевые моменты CAGR...»

«Управление библиотечных фондов (Парламентская библиотека) Аппарат Государственной Думы КАЛЕНДАРЬ ЗНАМЕНАТЕЛЬНЫХ ДАТ И СОБЫТИЙ ФЕВРАЛЬ 2016 ГОДА Пн Вт Ср Чт Пт Сб Вс 20* Ежемесячный выпуск Календаря знаменательных дат и событий, подготовленный Уп...»

«УДК 911. 52 ИЗ ОПЫТА СОЗДАНИЯ ГИС "ЛАНДШАФТЫ И БИОТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ТЕБЕРДИНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПРИРОДНОГО БИОСФЕРНОГО ЗАПОВЕДНИКА" В.В. Конева, С.Г. Лагун ГОУ ВПО "Ставропольский государственный университет", г. Ставрополь Рецензент А.И. Завражнов Ключевые слова и фразы: база данных Microsoft Of...»









 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.