WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 

«В этом докладе речь пойдет о внутриклеточных структурах, задействованных в процессах сортировки и транспорта белков из клетки наружу во внеклеточное пространство или на клеточную ...»

В этом докладе речь пойдет о внутриклеточных структурах, задействованных в

процессах сортировки и транспорта белков из клетки наружу во внеклеточное

пространство или на клеточную мембрану.

Мы изучаем фундаментальный клеточный процесс, так называемый секреторный

путь, необходимый для жизнеобеспечения клетки. Соответственно, наша

экспериментальная система – это живая эукариотическая животная клетка. Из

таких клеток состоим и мы, наш организм.

Главный экспериментальный инструментарий в этой работе - конфокальная микроскопия живой клетки, позволяющая наблюдать через микроскоп за живой клеткой, фотографировать ее и даже снимать фильмы. Такой микроскоп позволят увидеть и различить очень маленькие детали (разрешение до 0.1 микрометра), благодаря высокой контрастности и большому увеличению.

Кроме самого микроскопа, нам понадобится молекулярная биология для манипуляции над белками, чтоб придать им необходимые нам, экспериментаторам, свойства – пометить их светящимися флуоресцентными маркерами (флажками), чтоб дать нам возможность увидеть их в клетке, отличить друг от друга и проследить динамику внутри клетки, и даже прицельно направить белок в определенное место назначения внутри клетки, в нашем случае - по внутриклеточному секреторному пути.

Введение: Как устроена клетка, что такое органеллы?

Перед нами рисунок клетки и в нем органеллы -- специализированные замкнутые отсеки, окруженные внутриклеточными мембранами.

Термин «Органеллы» объясняется сопоставлением этих компонентов клетки с органами многоклеточного организма.

Компартментация позволяет создать разные, специфические условия для различных функций и процессов внутри клетки.

Клеточная мембрана (плазматическая мембрана) отделяет содержимое любой клетки от внешней среды, обеспечивая её целостность, и регулирует обмен между клеткой и средой.

Клеточная мембрана представляет собой двойной слой (бислой) молекул класса липидов, большинство из которых представляют собой так называемые сложные липиды — фосфолипиды. Молекулы липидов имеют гидрофильную и гидрофобную часть.

Биологическая мембрана включает и различные белки: интегральные (пронизывающие мембрану насквозь), полуинтегральные (погруженные одним концом во внешний или внутренний липидный слой), поверхностные (расположенные на внешней или прилегающие к внутренней сторонам мембраны.

Некоторые из интегральных белков выполняют функцию ионных каналов, различных транспортеров и рецепторов.

Цитоплазма -- внутренняя среда клетки, раствор, в котором и находятся органеллы, а также различные непостоянные структуры.

Так же она является смесью коллоидного (в него входят белки) и истинного раствора (минеральные соли, глюкоза, аминокислоты).

Основное вещество цитоплазмы — вода.

Цитоплазма постоянно движется, перетекает внутри живой клетки, перемещая вместе с собой различные вещества.

Важнейшая роль цитоплазмы заключается в объединении всех клеточных структур и обеспечении их химического взаимодействия.

Ядро - в нем находятся молекулы ДНК и обслуживающие их белки, например, те которые помогают длинным молекулам ДНК правильно упаковываться и сворачиваться, или белки которые копируют с молекулы ДНК определенный ген, синтезируя менее стабильную, временную молекулу, РНК. Этот процесс называется транскрипция. Такая РНК несет в себе нужную информацию для синтеза белка, поэтому после транскрипции (то есть, синтеза) покидает ядро и выходит в Цитоплазму.

Синтез белка начинается в цитоплазме, с помощью сложного белкового комплекса (рибосомы) умеющего синтезировать белок из аминокислот по заданной матрице на основе генетической информации, предоставляемой матричной РНК. Этот процесс называется трансляцией.

Те белки, которые функционируют не в цитоплазме, а в органеллах, или на мембранах имеют определенную короткую последовательность аминокислот, так называемый сигнальный пептид.

То есть, сама начальная растущая цепь белка уже является неким сигналом для транслокации внутрь органеллы ЭПР (Эндоплазматический Ретикулум).

Каждый белок, имеющий сигнальную последовательность и приведенный специальным рецептором к каналу ЭПР, продолжает расти и проталкивается внутрь ЭПР. После транслокации, то есть перемещения белка внутрь ЭПР, сигнальный пептид отсекается специальным энзимом.

Эндоплазматический ретикулум состоит из разветвлённой сети трубочек и карманов, окружённых мембраной.

Там, внутри Эндоплазматического Ретикулума, белки принимают правильную трехмерную структуру (некоторые – спонтанно, другие белки -- с помощью специальных вспомогательных белков) и прикрепление сахаров, необходимых для их функционирования.

После чего, правильно свернутые белки сортируются и путем отщепления участка мембраны и заключенные в ней отсортированные белки, транспортируются в органеллу, называемую Аппаратом Гольджи, где происходит дальнейшее преобразование белков и транспорт в место назначения белка. Таким образом, эндоплазматический ретикулум имеет функции не только транспорта белков, но и мембран, из которых и состоят переносчики (являющиеся фрагментами отщепленными от ЭПР). Маленькие мембранные сферические переносчики называются Везикулами или пузырьками, и транспортируются они моторными белками по микротрубочкам, как по рельсам. Микротрубочки представляют собой белковые внутриклеточные структуры, полые внутри цилиндры.

Комплекс Гольджи (на картинке – зеленая органелла) представляет собой стопку дискообразных мембранных мешочков (цистерн), несколько расширенных ближе к краям, и связанную с ними систему пузырьков Гольджи.

В Апарате Гольджи продолжаются модификации белков и после сортировки переносчики отправляются в места назначения, в случае секреторного пути - к плазматической мембране.

Мембрана везикулы сливается с клеточной мембраной и белки заключенные в полость везикулы выплескиваются наружу, а белки пронизывающие мембрану вместе с фосфолипидами везикулы вливаются в плазматическую мембрану.

Секреторный Путь Итак, речь пойдет о структурах, которые являются частью секреторного пути клетки (the secretory pathway). От слова секреция, выделение. То есть о системе выделения клетки. Выделения чего? Белков, и липидов и других молекул.

Выделение куда? Во внешнюю среду (например, гормоны) либо на плазматческую мембрану (например, рецепторы).

–  –  –

На фотографии видна клетка, в которую внедрили три такие искусственные ДНК молекулы кодирующие три белка – красный, находящийся в клеточной мембране, желтый белок органеллы Гольджи, и зеленый белок Эндоплазматического Ретикулума.

Если мы хотим изучать секреторный путь, то нам следует внедрить какой-нибудь секреторный белок, помеченный флуоресцентным маркером (флажком).

Какие требования будут к такому белку?

Чтоб белок был нетоксичным для клетки и чтоб умел эффективно проходить этот самый путь – ЭПР Гольджи Мембрана.

Мы используем белок, который называется VSVG.

Этот белок обладает всеми необходимыми свойствами - это мембранальный секреторный белок, то есть он умеет проходить нужный нам маршрут и его место назначения - клеточная мембрана, этот белок имеет флуоресцентный маркер и не токсичен клетке, даже если производится в огромных количествах.

–  –  –

Вернемся к секреторному белку VSVG.

В этом белке есть небольшая мутация, которая никак не мешает этому белку в обычных условиях, то есть в 37С. Но если немного поднять температуру до 39С, для клетки это будет небольшой стресс, но вполне терпимый, а белок VSVG уже не может свернуться правильно и поэтому не проходит проверку качества и застревает в ЭПР, ровно до тех пор, пока температура не опускается и белок тут же сворачивается как следует, и почти моментально транспортируется из ЭПР.

Благодаря этому отличительному свойству белка правильно и быстро сворачиваться в после денатурации (при 39С), мы можем синхронизировать процесс экспорта и следить за динамикой выхода белка из ЭПР будет намного проще.

Фильм начинается с того, что ЭПР однородно окрашен нашим белком, потому что клетки находились в 39С и белок VSVG застрял и не выходит из ЭПР.

В момент начала фильма температуру снижают и белок моментально концентрируется в скопления и носителями переносится в Гольджи, а потом оттуда, большими и маленькими носителями, переносится на клеточную мембрану, и поскольку этот белок интегральный, а значит, погружен в мембрану, то он остается на клеточной мембране и постепенно окрашивает ее собой. Мы можем видеть тут и там как отдельные светящиеся точки (мембранные носители) сливаются с мембраной и свечение распространяется и рассеивается по клеточной мембране.

Участки Экспорта – ER Exits Sites

–  –  –

Оболочка COPII – Coat Protein Complex COPII Известно, что COPII играет ключевую роль в процессе транспортировки белков из ЭПР и напрямую взаимодействует с секреторными белками и концентрирует их в Участках Экспорта в сотни раз, по сравнению с диффузным распределением белка в Эндоплазматическом Ретикулуме.

Белковый комплекс COPII известен среди биологов как окаймляющий белковый комплекс, создающий белковую оболочку мембранным пузырькам-носителям.

Его молекулярная структура хорошо изучена.

Известно, что имея согнутую, коромыслообразную форму субъединиц (Sec23/Sec24), этот белок может придавать мембране изгиб, непосредственно контактируя с мембраной и между субъединицами комплекса.

На этой картинке из учебника, мы видим процесс сборки такой COPII оболочки и образование пузырька носителя, под влиянием белка напрямую изгибающего мембрану. Секреторные белки изображены желтым и оранжевым.

–  –  –

Разделение между COPII и секреторными белками -- Segregation between COPII and cargo in dilated ERES VSVG COPII (Sec24C) В этой серии экспериментов в клетки прошли трансфекцию (внедрение кодирующих ДНК в клетку) с зеленым секреторным белком VSVG и красной субъединицей COPII, а затем обработаны BFA/NOC для расширения Участков Экспорта в сферические структуры. Напоминаю, что COPII считается структурным комплексом белковой оболочки, то есть покрывающим мембрану.

Здесь же, как и в других опытах с клетками без какой-либо химической обработки, COPII локализируется в отдельной точке на Участке Экспорта, а не распределен по внешнему периметру, как мы бы ожидали, исходя из предполагаемой функции комплекса оболочки.

Изображение, полученное с помощью микроскопа можно интерпретировать двумя способами, проиллюстрированными на схеме.

–  –  –

Непосредственная интеракция между COPII и секреторными белками необходима для сортировки и концентрации секреторных белков в Участках Экспорта ( COPII-dependent cargo selection and concentration in dilated ER Exit Sites, Dukhovny A, Papadopulos A, Hirschberg K. J Cell Sci. 2008) В клетки одновременно внедрили два варианта секреторного белка VSVG. Красный – обычный VSVG, и зеленый – мутантный VSVG.

Мутация зеленого варианта является заменой всего двух аминокислот, но в очень критическом месте в белке в последовательности, ответственной за интеракцию с комплексом COPII. Таким образом, одновременно клетка синтезирует два почти идентичных белка, помеченных разными маркерами, красный, умеющий химически привязывать COPII и зеленый вариант, не способный привязать COPII. На фотографии можно увидеть как обычный, красный секреторный белок концентрируется в Участках Экспорта, тогда как зеленый вариант не накапливается, и застревает в Эндоплазматическом Ретикулуме, не имея возможности продолжить секреторный путь. Этот результат однозначно показывает, что прямая интеракция между COPII и секреторным белком является необходимым условием для того чтоб секреторный белок мог покинуть ЭПР, и более того - чтоб такой белок мог зайти в Участки Экспорта из Эндоплазматического Ретикулума.

Фактически, получается, что COPII концентрирует один белок в Участки Экспорта и полностью не допускает второй, очень похожий, но потерявший способность на химическое узнавание COPII. Это первое свидетельство, на этом этапе, даже скорее намек на локализацию COPII на границе между Эндоплазматическим Ретикулумом и Участком Экспорта, так как подобный “контроль качества” комплекса COPII намного легче представить на входе в участок, чем в отдельной точке где-то на поверхности сферы.

–  –  –

Временное повышение локальной концентрации маркера Черри при коллапсе сферического Участка Экспорта (dERES) -- Transient rise of local concentration of luminal marker during collapse of dERESs В нормальных условиях, Участки Экспорта являются стабильными структурами, несмотря на динамичность мембран, и постоянного отщепления носителей из Участков Экспорта к Аппарату Гольджи. После обработки клеток веществами BFA/NOC, Участки Экспорта теряют искривление мембраны и приобретают сферическую форму. Транспорт белков в таких условиях полностью остановлен, и сферы аккумулируют секреторные белки до определенного момента, а потом обрушиваются и моментально смешиваются с мембранами Эндоплазматического Ретикулума. Через некоторое время после коллапса, на этом же месте, вновь возникает сферический Участок Экспорта и снова начинает концентрировать секреторные белки.

В этих экспериментах мы используем сразу три маркера:

Красный растворимый маркер внутренней среды Эндоплазматического Ретикулума – Черри, Зеленый трансмембранальный секреторный VSVG, и синюю субъединицу комплекса COPII Мы проанализировали динамику флуоресцентных сигналов каждого из белков в момент коллапса мембранной сферы для каждого Участка Экспорта.

–  –  –

При этом видно, что в некоторых случаях такое обрамление кластерами Участка Экспорта не строгое. Это можно объяснить гибкостью стебля, так как кластеры окружают Участок Экспорта у основания стебля, тогда как сфера имеет определенную свободу движения. Используемый зеленый маркер – VSVG.

В случае же использования флуоресцентно-помеченного COPII, можно увидеть более строгое и аккуратное обрамление кластерами Черри, что подразумевает локализацию комплекса COPII основания Участка Экспорта, что сильно отличается от общепринятой теории.

Напомню вкратце предыдущие результаты;

1. Секреторный белок VSVG и комплекс COPII локализованы вплотную друг к другу, но не совпадают, не накладываются полностью друг на друга, как мы бы ожидали бы от комплекса оболочки и секреторных белков (представляющих собой груз мембранного переносчика)

2. Кластеры Черри, находящиеся вплотную к мембране ЭПР, окружают сферический Участок Экспорта помеченный секреторным VSVG, но не строго.

3. Кластеры Черри аккуратно обрамляют структуры COPII.

В сочетании, эти результаты показывают сегрегацию между секреторными белками в сферической части Участка Экспорта и комплекса COPII, и, более того, предполагают локализацию COPII на границе между Эндоплазматическим Ретикулумом и Участком Экспорта из Эндоплазматического Ретикулума, в разрез с общепринятым мнением.

Общие результаты

1. Полость Участков Экспорта непрерывна с полостью Эндоплазматического Ретикулума.

2. Расширенные Участки Экспорта имеют структура сферы на стебле.

3. Стебель образует физическое препятствие на границе между Участком Экспорта и Эндоплазматической Сетью.

4. Отбор секреторных белков в Участки Экспорта являются COPIIзависимыми.

5. COPII находится на границе между Участком Экспорта и Эндоплазматической Сетью

COPII может полимеризоваться в трубочки -- COPII can polymerize to tubules

Два года назад была опубликована работа в Институте Молекулярной Биофизики, во Флориде, о том, что субъединицы COPII могут спонтанно собираться не только в сферические структуры, а так же в трубочки длинной примерно 0.33 микрометра и внутренним диаметром около 0.03 микрометра.

O'Donnell J, Maddox K, Staggs J. Struct. Biol. 2011

Это очень интересное открытие, так как до этого предполагались структуры создающие оболочку в форме сфер, а в эта работа дает некую физическую основу для предполагаемой структуры оболочки стебля и, возможно, даже намекает на механизм функционирования комплекса COPII как главного инспектора качества белков, находящегося на входе в Участок Экспорта, откуда секреторные

Похожие работы:

«ООО "Рейтинговое агентство "Эксперт-Рейтинг" (www.expert-rating.com, e-mail: general@expert-rating.com, тел./факс +38 044 207 08 81) Рейтинговый отчет (версия для публикации) (на основании Договора № 20 от 20 августа 2007) uaAA.amc Рейтинг надежности КУА по национальной шк...»

«84 А. Н. ЕРШОВ А. П. КУЛАПИН А. А. САЛАТОВА СОЦИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УПРАВЛЕНИЯ В УСЛОВИЯХ НЕСТАНДАРТНОЙ ЗАНЯТОСТИ Ключевые слова: нестандартная занятость, дифференцированный подход, духовность, группа, организация, рабоче...»

«АКТ приёма-передачи телекоммуникационного оборудования к Договору оказания услуг связи № от "_" 20_ г. г. Новокузнецк "_" 20_ г. Оператор: ООО "Е-Лайт-Телеком", в лице Директора филиала ООО "Е-Лайт-Телеком" в г. Новокузнецке Кемеровской области Корякина Ивана Викторовича, действ...»

«Под редакцией Томаса К. Эскола Дорогой Тимофей Письма служителю "Евангелие и жизнь" Саратов УДК 253 ББК 86.376-43 Э84 Dear Timothy Letters on Pastoral Ministry Edited by Thomas K. Ascol Founders Press, 2004 P.O. Box 150931 • Cape Coral, FL 33915 Translated and printed by TMAI by permission of Founders Press Перевод и подготовлена к изданию TMAI с...»

«УДК 81’25:82-97 М. В. Гуреева доц. каф. лингвистики и проф. коммуникации в области теологии МГЛУ; e-mail: mv1754@rambler.ru КОГНИТИВНО-ДИСКУРСИВНЫЙ ПОДХОД К РЕЧЕВОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ КАК ОСНОВА БАЗОВОГО УЧЕБНИКА ПО ПРОФЕССИОНАЛЬ...»

«прячем трафик от админа крис касперски ака мыщъх, a.k.a nezumi, a.k.a souriz, a.k.a. elraton, no-email до сих пор рассматриваемые нами способы маскировки трафика сводились к сокрытию сетевых соединений, но на физическом уровне весь левый трафик элементарно обнаруживался сни...»

«Цифровой видеорегистратор FE-009 Руководство пользователя Цифровой автономный видеорегистратор Falcon Eye FE-009 Содержание 1. Введение 2. Передняя панель 3. Задняя панель 4. Подготовка видеорегистратора к работе 5. Включение видеорегистратора 6. Ре...»

«Руководство по эксплуатации az UX 3200 Special UX 4200 Special Прицепной опрыскиватель Перед первым вводом в эксплуатацию обязательно прочитайте настоящее руководство по эксплуатации и в MG3432 дальнейшем соблюдайте его BAG0035.11 11.16 P...»









 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.