WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«Способность губок классов Demospongiae и Calcarea к развитию из диссоциированных клеток ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук ...»

-- [ Страница 2 ] --

Видовую принадлежность губок определяли по организации скелета и спикулам (Колтун, 1959, 1966; Ересковский, 1987). Препараты спикул для исследования под световым микроскопом изготавливали, обрабатывая небольшой участок тканей губки концентрированной соляной кислотой при температуре 60°C (Колтун, 1959).

В работе было использовано 40 особей H. panicea, 43 особи H. dujardinii, 24 особи L. complicata и 8 особей H. aquaeductus (Таблица 2). Реагрегация клеток у H. aquaeductus и L. complicata была исследована только на взрослых особях, которые находились на стадии роста, предшествующего половому размножению. Эксперименты с H. aquaeductus проводили в июле 2011 и 2012, а с L. complicata – в июле-августе 2013 и

2015. Реагрегация клеток у H. panicea и H. dujardinii была исследована при разных физиологических состояниях тканей, связанных с репродуктивным циклом данных видов. У H. panicea реагрегация была исследована на взрослых особях, 1) в период роста, предшествующего половому размножению, 2) в период гаметогенеза, 3) в период эмбриогенеза и 4) в период восстановления соматических тканей после выхода личинок и пострепродуктивного роста (Таблица 2). У H. dujardinii реагрегация исследовалась на взрослых особях 1) в период гаметогенеза, 2) в период эмбриогенеза и 3) в период восстановления соматических тканей после выхода личинок и пострепродуктивного роста (Таблица 2). Сроки наступления различных стадий репродуктивного цикла исследованных видов были определены по литературным данным (Иванова, 1981;

Ересковский, 1994; Ereskovsky, 2000; Gerasimova, Ereskovsky, 2007), а стадия репродуктивного цикла конкретной особи определялась путем визуального изучения живых тканей под стереомикроскопом Leica M165FC (Leica, Germany) и микроскопом Leica DM2500 (Leica, Germany). Хотя физиологическое состояние губок в период восстановления соматических тканей после выхода личинок и в период пострепродуктивного роста вероятно различается, в данной работе эти периоды рассматриваются вместе, поскольку в использованных литературных источниках данные периоды также не разделяют. Осмотр живых тканей губок под стереомикроскопом и микроскопом не выявил отличий между особями, которые позволили бы надежно разделить эти стадии репродуктивного цикла.

2.2. Диссоциации тканей

Диссоциацию тканей губок проводили в нестерильных условиях, однако использовали стерильную морскую воду (FSW) в ходе самой процедуры, а также в ходе последующей диссоциации культивации суспензий клеток. Это позволило предотвратить дополнительную контаминацию культур простейшими и бактериями.

Для определения наиболее эффективного метода диссоциации тканей губок ткани H. panicea, H. dujardinii и L.

complicata в ходе предварительных исследований были диссоциированы одним из трех методов:

Механическая диссоциация (по Wilson, 1907). Ткани губок измельчали с 1.

помощью пинцета и скальпеля в FSW. Измельченные фрагменты тканей протирали сквозь мельничный газ с размером ячеи 50 мкм в емкость с FSW.

Химическая диссоциация (по Humphreys, 1963). Ткани губок измельчали с 2.

помощью пинцета и скальпеля в безкальциевой и безмагниевой искусственной морской воде с добавлением ЭДТА (CMFSW-E). Измельченные фрагменты ткани в емкости с 40 мл CMFSW-E помещали на орбитальный шейкер на 60 минут при 70 об/мин. Через 60 минут сливали супернатант из емкости, а оставшиеся ткани заливали 40 мл чистой CMFSW-E и возвращали на шейкер на 120 минут при 70 об/мин. Через 120 минут супернатант, содержащий клетки, (супернатант 1) сливали в отдельную емкость, а оставшиеся ткани заливали 40 мл чистой CMFSW-E и возвращали на шейкер на 120 минут при 70 об/мин. Через 120 минут супернатант, содержащий клетки, (супернатант

2) сливали в отдельную емкость. Для удаления мусора, крупных многоклеточных агрегатов и спикул из супернатантов 1 и 2 применяли фильтрование через мельничный газ с размером ячеи 50 мкм. Супернатант 1 и 2 сливали вместе и центрифугировали 10 минут при 800 g для осаждения клеток. Для предотвращения нагревания образцов во время центрифугирования ротор центрифуги предварительно охлаждали. Осажденные клетки дополнительно отмывали от остатков CMFSW-E, которые могли негативно повлиять на последующий процесс реагрегации клеток. В ходе отмывок осажденные клетки заливали FSW, ресуспендировали и помещали на орбитальным шейкер при 70 об/мин. Каждые 30 минут проводили смену FSW – центрифугировали суспензии 3 минуты при 800g, а затем ресуспендировали в свежей порции FSW. Всего проводили по три смены FSW для каждой суспензии.

Механо-химическая диссоциация. Ткани губок измельчали с помощью пинцета 3.

и скальпеля в CMFSW-E. Измельченные фрагменты тканей протирали сквозь мельничный газ с размером ячеи 50 мкм в емкость с CMFSW-E. Полученные суспензии клеток помещали на орбитальный шейкер на 60 минут при 70 об/мин. Через 60 минут суспензии клеток центрифугировали 10 минут при 800 g для осаждения клеток. Для предотвращения нагревания образцов во время центрифугирования ротор центрифуги предварительно охлаждали. Осажденные клетки дополнительно отмывали от остатков CMFSW-E, которые могли негативно повлиять на последующий процесс реагрегации клеток. В ходе отмывок осажденные клетки заливали FSW, ресуспендировали и помещали на орбитальным шейкер при 70 об/мин. Каждые 30 минут проводили смену FSW – центрифугировали суспензии 3 минуты при 800 g, а затем ресуспендировали в свежей порции FSW. Всего проводили по три смены FSW для каждой суспензии.

Поскольку тела особей L. complicata несли большое количество детрита на своей поверхности, фрагменты тканей этих губок дополнительно дважды промывали FSW или CMFSW-E перед диссоциацией.

Сравнительные эксперименты показали, что механический метод диссоциации тканей был наиболее оптимальным (см. раздел 3.1). Поэтому в дальнейших исследованиях были использованы суспензии клеток, полученные этим методом.

Для получения FSW использовали фильтры Millex-GP с размером пор 0,22 мкм (Merck Millipore, USA).

Использованная в работе CMFSW-E (0,3М NaCl, 0,02М KCl, 0,01М Tris-HCl, 0,015М ЭДТА) была изоосмотична местной морской воде и имела pH 7.2. Необходимое значение pH получали добавлением концентрированного NaOH.

–  –  –

Из полученных суспензий клеток отбирали аликвоты (10 мкл) для определения концентрации клеток с помощью камеры Горяева. Затем суспензии клеток разводили FSW до концентрации 1107-3107 кл/мл. В ходе предварительных исследований было показано, что процесс реагрегации идет наиболее успешно при данных концентрациях клеток (Лавров, 2012). Трехкратные различия в концентрации клеток не оказывали заметного влияния на ход и скорость процесса реагрегации у исследованных видов. В ходе предварительных исследований жизнеспособность клеток в суспензии оценивалась путем их окраски комбинацией флуоресцентных красителей – йодида пропидия (Biotium, USA) и Hoechst 33342 (Biotium, USA) (Лавров, 2012). Во всех случаях суспензии содержали менее 1% мертвых клеток. В дальнейших экспериментах мы считали, что жизнеспособность клеток остается такой же.

Суспензии клеток разливали в чистые пластиковые чашки Петри диаметром 30 мм. В каждую чашку помещали 5 мл суспензии. Из каждой особи H. panicea и H. aquaeductus получали 5-10 чашек Петри с суспензией клеток, из каждой особи H. dujardinii и L. complicata – 2-5 чашки Петри с суспензией клеток.

Культуры клеток содержали в FSW при температуре 8-10°С. Для интенсификации процесса реагрегации культуры клеток помещали на орбитальный шейкер при скорости вращения 70 об/мин. Культуры клеток H. panicea, H. aquaeductus и L. complicata содержали на шейкере в течение первых 24 часов после диссоциации тканей, культуры клеток H. dujardinii – в течение первого часа после диссоциации тканей. Каждые 48 часов производили замену половины культуральной среды на свежую FSW. Каждые 24 часа на протяжении всего времени культивирования проводили визуальное обследование чашек Петри и делали фотографии многоклеточных агрегатов с помощью стереомикроскопа Leica M165FC (Leica, Germany) оборудованного цифровой камерой Leica DFC 320 и программным обеспечением Leica LAS Store and Recall v.3.6.

Для изучения медленных процессов, происходящих в агрегатах и примморфах, проводили цейтраферную видеосъемку при постоянном освещении. Съемки проводили при температуре 10-12°С в течении 1-24 часов с помощью стереомикроскопов МБС-2 и МБС-9, оборудованных цифровой окулярными камерами DCM130 и DCM310 (Shangrao TeleView Optical Instruments, China) и программным обеспечением ScopePhoto v. 3.1.

Жизнеспособность агрегатов определялась по их внешнему виду:

нежизнеспособные агрегаты быстро теряли характерную форму, их поверхность становилась очень неровной. Эти процессы сопровождались активным выходом из состава агрегатов отдельных клеток. Гибель агрегатов сопровождалась их полной диссоциацией.

2.4. Оценка влияния характера субстрата и переноса культур в аквариум с естественной морской водой на реагрегацию клеток и последующее развитие примморфов В ходе предварительных исследований были определены оптимальные значения наиболее важных параметров для успешного протекания процесса реагрегации клеток исследованных видов: 1) температура, 2) время культивирования на орбитальном шейкере, 3) концентрация клеток в суспензии (Лавров, 2012). При этих условиях культивировали большую часть исследованных культур клеток (см. раздел 2.3).

В настоящей работе также было исследовано влияние на процесс реагрегации клеток и последующее развитие примморфов характера субстрата для прикрепления примморфов и ранних примморфов и переноса культур в аквариум с естественной морской водой.

Для исследования возможности прикрепления примморфов (H. panicea и H. dujardinii) и ранних примморфов (H. aquaeductus и L. complicata) к различным субстратам, агрегаты переносили на один из четырех субстратов: 1) чистое покровное стекло размером 2424 мм, 2) покровное стекло размером 2424 мм, покрытое поли-Dлизином, 3) покровное стекло размером 2424 мм, покрытое поли-L-лизином и 4) покровное стекло размером 2424 мм, покрытое желатином. Каждое покровное стекло помещали в отдельную чашку Петри диаметром 30 мм с FSW, куда затем переносили 10-15 примморфов или ранних примморфов. Эксперимент повторяли 2-3 раза с агрегатами, полученными от разных особей каждого исследованного вида. Если агрегаты не прикреплялись к субстрату в течение трех суток, эксперимент заканчивали и считали, что агрегаты не способны прикрепляться к данному субстрату.

Кроме того, проводили оценку влияния указанных субстратов на ранние этапы реагрегации клеток. Для этого суспензии клеток каждого вида, полученные стандартным методом, сразу после получения переносили на соответствующий субстрат. В остальном условия культивирования не отличались от стандартных. Опыты повторяли 2-3 раза с суспензиями, полученными от разных особей каждого исследованного вида. В качестве контроля использовали суспензии клеток, полученные от тех же особей, но культивировавшиеся в пластиковых чашках Петри.

Для оценки влияния переноса многоклеточных агрегатов в аквариум с естественной морской водой на их развитие дальнейшее развитие, часть агрегатов исследованных видов, сформировавшихся в культурах через 24 часа после диссоциации тканей, переносили в открытых чашках Петри диаметром 30 мм в аквариум с биологическими фильтрами (100 л, естественная морская вода, ежедневная замена 10% объема) для дальнейшего культивирования. Чашки Петри помещали у поверхности аквариума, так чтобы агрегаты были покрыты слоем воды толщиной 4-5 см, что позволяло обследовать чашки Петри с помощью стереомикроскопа МБС-2 непосредственно в аквариуме. Остальные условия культивирования данных агрегатов не отличались от основной группы.

2.5. Фиксация многоклеточных агрегатов

Часть полученных в культурах многоклеточных агрегатов фиксировали каждые 48 часов на протяжении всего времени культивирования. Фиксацию агрегатов H. dujardinii проводили только в культурах, полученных от особей в период пострепродуктивного роста, так как наши исследования характера протекания реагрегации клеток в зависимости от стадии репродуктивного цикла губки показали, что в этот период является наиболее благоприятным для реагрегации клеток данного вида.

Фиксацию агрегатов H. panicea проводили в культурах, полученных от особей в период роста, предшествующего половому размножению и в период гаметогенеза. Хотя наиболее благоприятным для реагрегации клеток периодом репродуктивного цикла H. panicea является период роста, предшествующего половому размножению, сбор губок для проведения опытов в этот сезон (март-апрель) затруднен, что помещало сбору достаточного количества материала. В целом, характер протекания реагрегации клеток H. panicea в культурах, полученных от особей в период роста, предшествующего половому размножению, и в период гаметогенеза, сходен.

Зафиксированные агрегаты исследовали гистологическими, ультраструктурными и иммуногистохимическими методами.

–  –  –

Для выявления наилучшей методики фиксации в ходе предварительных исследований многоклеточные агрегаты были зафиксированы следующими фиксаторами:

2,5% глютаровый альдегид (Ted Pella, USA) на фосфатном буфере Миллонига 1) (pH=7.2-7.4), изоосмотичном местной морской воде (830 мОсм) (Millonig, 1964), с постфиксацией 2% тетраоксидом осмия на том же буфере;

2,5% глютаровый альдегид на FSW с постфиксацией 2% тетраоксидом осмия на 2) FSW;

2,5% глютаровый альдегид на фосфатном буфере Миллонига (pH=7.2-7.4), 3) изоосмотичном местной морской воде (830 мОсм) (Millonig, 1964) с постфиксацией 1% тетраоксидом осмия на том же буфере;

2,5% глютаровый альдегид на 0,2 M натрий-какодилатном буфере (Sigma-Aldrich, 4) USA) с постфиксацией 1% тетраоксидом осмия на том же буфере;

2,5% глютаровый альдегид на FSW с постфиксацией 1% тетраоксидом осмия на 5) FSW;

Префиксация 2% тетраоксидом осмия на 0,2 M натрий-какодилатном буфере, 6) фиксация 2,5% глютаровым альдегидом на том же буфере и постфиксация 2% тетраксидом осмия на том же буфере;

2,5% глютаровый альдегид : 0,4 М натрий-какодилатный буфер : морская вода (в 7) соотношении 1:2:7) с постфиксацией 2% тетраоксидом осмия на 0,2 М какодилатном буфере (Boury-Esnault et al., 1984);

2,5% глютаровый альдегид : 0,4 М натрий-какодилатный буфер : морская вода (в 8) соотношении 1:4:5) с постфиксацией 2% тетраоксидом осмия на 0,2 М какодилатном буфере (Boury-Esnault et al., 1984);

1,25% формалин – 2,5% глютаровый альдегид – 0,03% пикриновая кислота на 9) 0,2 М натрий-какодилатном буфере;

1,25% формалин – 2,5% глютаровый альдегид – 0,03% пикриновая кислота на 10) FSW.

Наилучшие результаты фиксации были получены при использовании 2,5% глютарового альдегида на фосфатном буфере Миллонига (Millonig, 1964) с постфиксацией 1% тетраоксидом осмия на том же буфере. Только этот фиксатор был использован в ходе основных исследований.

Фиксацию агрегатов проводили 12-24 часов при 4°С. Затем агрегаты дважды отмывали в фосфатном буфере Миллонига в течении 30 минут и подвергали постфиксации в течении 1-2 часов в темноте при комнатной температуре. После постфиксации многоклеточные агрегата еще дважды отмывали в фосфатном буфере Миллонига. Затем агрегаты H. panicea и H. aquaeductus помещали в 10% HF на 2-3 часа, а агрегаты L. complicata – в 5% HCl на 1-2 часа для удаления спикул и их обломков.

Многоклеточные агрегаты H. dujardinii не нуждались в растворении спикул, так как у этого вида губок отсутствует минеральный скелет. После процедуры растворения спикул агрегаты еще дважды отмывали фосфатным буфером и постепенно переводили в 70% этиловый спирт для последующего хранения.

2.5.2. Фиксация многоклеточных агрегатов для иммуногистохимических исследований

Фиксацию агрегатов проводили 2,5% глютаровым альдегидом (Ted Pella, USA) на фосфатном буфере Миллонига (pH=7.2-7.4), изоосмотичном местной морской воде (830 мОсм) на протяжении 12-24 часов при 4°С. Затем агрегаты дважды отмывали в фосфатном буфере и дважды – в PBS. Зафиксированные агрегаты хранили в PBS не более трех суток.

2.6. Гистологическое исследование многоклеточных агрегатов Для проведения гистологических исследований зафиксированные многоклеточные агрегаты обезвоживали и заключали в эпоксидную смолу Araldite502/Embed-812 embedding media (Electron Microscopy Sciences, USA) средней твердости в соответствии со следующей прописью:

I. Дегидратация:

1) Этиловый спирт 70%;

2) Этиловый спирт 80% – 2х10 минут, комнатная температура;

3) Этиловый спирт 96% – 2х20 минут, комнатная температура;

4) Этиловый спирт 96% : ацетон (2:1) – 15 минут, комнатная температура;

5) Этиловый спирт 96% : ацетон (1:1) – 15 минут, комнатная температура;

6) Ацетон – 2х15 минут, комнатная температура.

II. Пропитка эпоксидной смолой:

1) Смола : ацетон (1:2) – 24 часа, комнатная температура;

2) Смола : ацетон (2:1) – 24 часа, комнатная температура;

3) Смола : ацетон (3:1) – 24 часа, комнатная температура;

4) Чистая смола – 6 часов, комнатная температура;

5) Чистая смола – 24 часа, 37°С;

6) Чистая смола – 48 часов, 60°С.

С помощью ультратомов LKB Ultratome 3 (LKB, Sweden) и Leica EM UC6 (Leica, Germany) получали полутонкие срезы многоклеточных агрегатов толщиной 1-2 мкм.

Срезы окрашивали смесью 1% толуидинового и 0,2% метиленового синего на 1% растворе тетрабората натрия (Миронов и др., 1994) и изучали под микроскопом Leica DM5000B (Leica, Germany).

2.7. Ультраструктурное исследование многоклеточных агрегатов

Для исследований под сканирующим электронным микроскопом (СЭМ) агрегаты постепенно обезвоживали в серии этанолов повышающейся концентрации и постепенно переводили в ацетон. Затем образцы высушивали в критической точке с помощью Hitachi Critical Point Dryer HCP-2 (Hitachi, Japan), напыляли золотом и платиной. Для изучения внутреннего строения часть агрегатов перед сушкой в критической точке помешали в жидкий азот и раскалывали (в этом случае в финальной стадии обезвоживания использовали не ацетон, а 100% этанол). Изучение проводили с помощью микроскопов CamScan S-2 и Jeol JSM6380-LA (Jeol, Japan).

Для исследований под трансмиссионным электронным микроскопом (ТЭМ) ультратонкие срезы многоклеточных агрегатов, полученные с помощью ультратома Leica EM UC6 (Leica, Germany), контрастировали с помощью 4% водного раствора уранилацетата (40 мин, при температуре 37°) и 0,4% раствора цитрата свинца (15-20 мин, в темноте при комнатной температуре, в присутствии гранулированного NaOH) по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Полученные срезы изучали под микроскопами Jeol JEM-100B и Jeol JEM-1011 (Jeol, Japan).

2.8. Иммуногистохимическое исследование многоклеточных агрегатов Для прослеживания судьбы хоаноцитов зафиксированные многоклеточные агрегаты H. panicea, H. dujardinii и L. complicata окрашивались антителами к -тубулина в соответствии со следующей прописью:

Отмывка PBS (Fluka, Germany) – 2х30 минут, комнатная температура;

1) Отмывка PBS-Borax – 2х30 минут, комнатная температура;

2) Отмывка 3% BSA (Sigma-Aldrich, USA) на PBS – 2х1 час, комнатная температура;

3) Отмывка блокирующим раствором (1% BSA, 0,1% cold-water fish skin gelatin 4) (Sigma-Aldrich, USA), 0,5% Triton X-100 (Ferak Berlin, Germany), 0,05% Tween 20 (Ferak Berlin, Germany) на PBS) – 1 час, комнатная температура;

Инкубация в первичных мышиных антителах к -тубулину (разведение 1:1000;

5) Sigma-Aldrich, USA) – 24 часа, 4°С;

Отмывка блокирующим раствором – 2х1 час, комнатная температура;

6) Инкубация во вторичных ослиных антителах Donkey Anti-mouse IgG Alexa 546 7) (разведение 1:500; Thermo Fisher Scientific, USA) – 24 часа, в темноте, 4°С;

Отмывка PBS – 2х30 минут, в темноте, комнатная температура;

8) Окраска 150 мМ раствором DAPI (Sigma-Aldrich, USA) – 1 час, в темноте, 9) комнатная температура;

Отмывка PBS – 3х10 минут, в темноте, комнатная температура;

10)

–  –  –

В качестве отрицательного контроля использовали многоклеточные агрегаты, которые не инкубировали в первичных антителах. В остальном пропись работы с этими образцами совпадала с приведенной выше.

Препараты многоклеточных агрегатов исследовали на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Nikon A1 (Nikon, Japan) с использованием лазеров с длинной волны испускаемого света 408 нм и 546 нм. В ходе работы получали оптические срезы образцов каждые 0,3-0,5 мкм. Z-проекции получали с помощью программного обеспечения Image J v. 1.48 (National Institute of Health, USA).

–  –  –

Измерения размеров многоклеточных агрегатов проводили по фотографиям культур, сделанных до фиксации агрегатов, с помощью программного обеспечения Leica LAS Store and Recall v.3.6 (Leica, Germany). Так как в большинстве случаев агрегаты имели форму, близкую к сферической, то в качестве размеров агрегатов указаны их наибольший диаметр. Измерения проводили два раза за время культивирования агрегатов: 1) в конце периода культивирования на орбитальном шейкере (размер первичных многоклеточных агрегатов) и 2) после формирования примморфов (H. panicea, H. dujardinii) или ранних примморфов (H. aquaeductus, L. complicata).

Измерение объектов на электронно-микроскопических фотографиях проводили с помощью программы JR Screen Ruller v. 1.5 (Spadix Software).

Во всех случаях приводится средний размер объектов, стандартное отклонение и количество измерений (n).

–  –  –

3.1. Влияние метода диссоциации тканей на процесс реагрегации клеток Суспензии клеток и полученные химическим, H. panicea H. dujardinii, механическим или механо-химическим методом диссоциации тканей, содержали живые клетки. Метод диссоциации тканей не оказывал заметного влияния на качественный состав суспензии и поведение клеток (подробнее см. раздел 3.2). Единственным отличием было уменьшение размеров групп клеток, состоящих из недиссоциировавших хоаноцитов, при использовании химической и механо-химической диссоциации.

При дальнейшем культивировании клетки в суспензиях, полученных любым из методов диссоциации тканей, были способны к реагрегации и формированию первичных многоклеточных агрегатов.

Однако суспензии, полученные химическим методом диссоциации тканей, всегда имели низкую концентрацию клеток (меньше, чем 1107 кл/мл), которая не позволяла получать культуры с необходимой концентрацией клеток. С помощью механического и механо-химического методов диссоциации удавалось получить суспензии клеток сходных высоких концентраций (от 1107 до 7107 кл/мл). Но поскольку механомеханический метод требовал гораздо больше времени и включал в себя центрифугирование клеток при высоких ускорениях, в качестве основного метода диссоциации тканей был выбран механический.

3.2. Поведение клеток в суспензии и начальные этапы реагрегации

Получаемые после диссоциации тканей суспензии клеток всех изученных видов содержали живые клетки. Клетки активно формировали псевдоподии, количество и форма которых варьировала. Встречались как клетки, несущие единственную псевдоподию, так и клетки, формирующие большое количество псевдоподий (Рисунок 18А, Б). В большинстве случаев клетки формировали филоподии, реже встречались клетки с лобоподиями. Видоспецифичных особенностей поведения клеток в суспензии обнаружено не было.

Клетки всех исследованных видов имели небольшие размеры (до 20 мкм) и в ходе диссоциации тканей теряли ряд диагностических признаков (форма, положение в теле).

В связи с этим идентификация типов клеток в суспензии на свето-оптическом уровне была сильно затруднена. Тем не менее, в суспензии клеток H. dujardinii удалось выделить два типа клеток с включениями – сферульные и гранулярные (Рисунок 18В, Г).

Кроме того, в суспензиях всех изученных видов удалось идентифицировать хоаноциты, которые сохраняли жгутик и могли двигаться за счет его биения (Рисунок 18Д). Часто хоаноциты встречались в виде недиссоцировавших групп. Вероятно, это части хоаноцитных камер, которые сохраняли целостность несмотря на процедуру диссоциации.

Хоаноциты были единственным подвижным типом клеток у исследованных губок. Остальные клетки, несмотря на активное формирование псевдоподий, оставались неподвижными. Клетки использовали псевдоподии для обследования пространства вокруг себя. При контакте псевдоподий двух клеток, эти клетки начинали сближаться друг с другом за счет сокращения псевдоподий (Рисунок 19). Вероятно, именно таким образом происходило образование первых многоклеточных агрегатов, которые включали в себя несколько десятков клеток (Рисунок 20А).

Клетки в составе агрегатов продолжали формировать псевдоподии (Рисунок 20Б).

В составе агрегатов H. dujardinii клетки начинали образовывать преимущественно лобоподии, вместо филоподий. Многоклеточные агрегаты постепенно увеличивались в размерах благодаря присоединению новых клеток или объединению с другими агрегатами за счет описанного выше механизма реагрегации. Кроме того, хоаноциты, входящие в состав агрегатов, сохраняли жгутики, который продолжали биться. За счет биения нескольких жгутиков некрупные многоклеточные агрегаты могли совершать хаотические движения, в результате которых они контактировали друг с другом и сливались, образуя более крупные агрегаты. Такой механизм увеличения размеров агрегатов был обнаружен у L. complicata благодаря цейтраферной съемке ранних этапов реагрегации. Форма первых многоклеточных агрегатов всех исследованных видов губок была разнообразна и часто отличалась от округлой.

На начальных этапах реагрегации суспензии клеток всех видов культивировали на орбитальном шейкере. Это позволяло интенсифицировать контакты между клетками и получать более крупные первичные многоклеточные агрегаты. Предварительные исследования показали, что оптимальное время культивирования на орбитальном шейкере для суспензии клеток H. aquaeductus, H. panicea и L. complicata составляет 24 часа, а для суспензий H. dujardinii – 1 час. За время культивирования на орбитальном шейкере в культурах клеток всех видов формировались первичные многоклеточные агрегаты сходных размеров (Таблица 3, 4). Более продолжительное культивирование на орбитальном шейкере приводило к формированию одного или нескольких крупных агрегатов размером до 10 мм, в состав которых входила большая часть клеток культуры (Рисунок 21). Такие агрегаты были нежизнеспособны и погибали в течение нескольких последующих суток. Формирование подобных крупных агрегатов, но меньших размеров (2-4 мм), происходило и в некоторых культурах исследованных видов, которые культивировали на орбитальном шейкере оптимальное время. Эти крупные агрегаты также были нежизнеспособны, и их удаляли из культур.

–  –  –

В ходе экспериментов были исследованы культуры клеток, полученные от 23 особей L. complicata. Культуры клеток всех особей были жизнеспособны, и в них начиналась реагрегация. Однако культуры, полученные от шести особей, погибли на ранних этапах процесса (в течение 2-4 спд (сутки после диссоциации)). Приведенные ниже данные получены при наблюдениях культур клеток, полученных от 17 особей L. complicata, которые культивировали более 5 спд (Таблица 2; Рисунок 22).

К 24 чпд во всех культурах L. complicata формировались первичные многоклеточные агрегаты (Таблица 3; Рисунок 22). Эти агрегаты имели размеры 105±37 мкм (n=120) и разнообразную форму – от округлой до сложной разветвленной (Таблица 4; Рисунок 23А). Очертания агрегатов были крайне неровными. Во всех культурах первичные агрегаты несли на своей поверхности полупрозрачные пузыри, стенка которых образована клетками самого агрегата (см. раздел 3.6.1). В большинстве случаев пузыри появлялись к 24 чпд, реже – к 48 чпд.

В течение нескольких следующих суток первичные многоклеточные агрегаты сливались друг с другом, увеличиваясь в размерах. Одновременно с этим происходило увеличение размера и количества пузырей на агрегате. Кроме того, стенка пузырей становилась более прозрачной (Рисунок 23Б).

К 5-7 спд первичные многоклеточные агрегаты трансформировались в ранние примморфы, которые имели размер 347±130 мкм (n=76), округлую или овальную форму и более ровные очертания по сравнению с первичными агрегатами (Таблица 3, 4;

Рисунок 22, 23В, Г). В ряде культур при формировании ранних примморфов пузыри исчезали с их поверхности (Рисунок 23В), но в большинстве случаев ранние примморфы несли довольно крупные пузыри (Рисунок 23Г).

В культурах, полученных от одной из особей, произошло прикрепление ранних примморфов к дну чашки Петри на 7 сутки. Этот процесс сопровождался уплощением примморфов и их активным слиянием. В результате в культуре сформировалось несколько крупных (до нескольких миллиметров) прикрепленных агрегатов, которые несли на своей апикальной стороне большое количество пузырей (Рисунок 22, 23Д). В остальных культурах L. complicata прикрепления ранних примморфов к субстрату не происходило.

Мы никогда не наблюдали восстановления исходной организации губки в культурах L. complicata. После своего формирования ранние примморфы сохраняли жизнеспособность в среднем до 11-12 спд (4-7 суток после формирования), после чего погибали (Рисунок 22). Максимальная продолжительность жизни ранних примморфов в культуре составила 25 спд (20 суток после формирования) (Таблица 2).

3.2.2. Haliclona aquaeductus

В ходе экспериментов были исследованы культуры клеток, полученные от восьми особей H. aquaeductus. Все они оказались жизнеспособными, и в них начинался процесс реагрегации. Однако, культура клеток, полученная от одной из особей, погибла на ранних этапах реагрегации (3 спд). Приведенные ниже данные основаны на наблюдениях за культурами клеток, полученными от семи особей H. aquaeductus, которые культивировали более 7 спд (Таблица 2; Рисунок 24).

К 24 чпд в культурах клеток этого вида формировались первичные многоклеточные агрегаты округлой или овальной формы (Таблица 3; Рисунок 24, 25А).

Средний размер агрегатов составлял 265±135 мкм (n=150) (Таблица 4).

К 3 спд начинался процесс трансформации первичных многоклеточных агрегатов.

Он сопровождался выделением из агрегатов рыхлого материала, что приводило к образованию вокруг них прозрачной оболочки (Рисунок 25Б). К 6–7 спд агрегаты освобождались от этой оболочки, приобретали правильную сферическую форму, выглядели более плотными, но их поверхность оставалась неровной (Рисунок 25В).

Данную стадию реагрегации клеток H. aquaeductus можно охарактеризовать как ранние примморфы (Таблица 3; Рисунок 24). Ранние примморфы данного вида имели размер 1055±410 мкм (n=47) (Таблица 4).

Ранние примморфы H. aquaeductus сохраняли жизнеспособность в культуре в среднем до 14 спд (7-8 суток после формирования). Максимальная продолжительность жизни ранних примморфов данного вида составила 20 спд (14 суток после формирования) (Таблица 2). При этом мы не наблюдали дальнейшего развития агрегатов, в том числе и прикрепления к субстрату.

3.2.3. Halichondria panicea

Период роста, предшествующего половому размножению. В ходе экспериментов были исследованы культуры клеток, полученные от пяти особей, которые находились на данной стадии репродуктивного цикла. Их ткани не содержали гамет или развивающихся эмбрионов. Культуры клеток, полученные от всех особей, были жизнеспособны, и наблюдения за ними проводили более 7 спд (Таблица 2).

К 24 чпд во всех культурах формировались первичные многоклеточные агрегаты, которые имели неровную поверхность и разнообразную форму (от округлой до сложно разветвленной) (Таблица 3; Рисунок 26А, 27). Размер этих агрегатов составлял 262±136 мкм (n=52) (Таблица 4).

В течение следующих 1-2 суток первичные агрегаты постепенно преобразовывались в ранние примморфы (Рисунок 27). В ходе этого процесса агрегаты становились более плотными, приобретали более правильную округлую форму и увеличивались в размерах, однако их поверхность оставалась неровной (Рисунок 26В).

В культурах двух особей ранние примморфы были последней стадией реагрегации и не развивались в дальнейшем. В культурах трех других особей к 5 спд ранние примморфы приобретали гладкую поверхность и, таким образом, преобразовались в настоящие примморфы (Таблица 3; Рисунок 26Г, 27).

После своего окончательного формирования настоящие примморфы имели размер 365±203 мкм (n=39) (Таблица 4) и не проявляли признаков дальнейшего развития. Примморфы сохраняли жизнеспособность в культурах более 12 спд (точное время жизни не определялось, так как все агрегаты были зафиксированы для гистологических и ультраструктурных исследований) (Таблица 2).

Период гаметогенеза. В ходе экспериментов были исследованы культуры клеток, полученные от 15 особей, которые находились на данной стадии репродуктивного цикла. Культуры клеток, полученные от всех особей, оказались жизнеспособными, и в них начинался процесс реагрегации. Однако культуры клеток, полученные от трех особей, погибли на ранних этапах этого процесса (1-2 спд). Приведенные ниже данные основаны на наблюдениях за культурами клеток, полученными от 12 особей H. panicea (11 самцов и 1 самка), которые культивировали более 5 спд (Таблица 2; Рисунок 28).

Различий в темпе и характере реагрегации клеток в культурах, полученных от самцов и самок, обнаружено не было.

К 24 чпд во всех культурах клеток происходило формирование большого количества первичных многоклеточных агрегатов, средний размер которых составлял 222±78 мкм (n=118) (Таблица 3, 4; Рисунок 28). Данные агрегаты имели округлую или сложную разветвленную форму (Рисунок 26A).

На 3 спд вокруг многоклеточных агрегатов появлялась тонкая полупрозрачная оболочка, и начинался процесс трансформации первичных многоклеточных агрегатов (Рисунок 28, 26Б). В течение нескольких последующих суток оболочка из клеточного дебриса постепенно увеличивалась и часто по объему становилась больше агрегата, который окружала. Иногда во время трансформации наблюдалось разделение агрегатов сложной разветвленной формы на несколько более мелких агрегатов, находящихся в общей оболочке. В целом, этот весь процесс сходен с трансформацией первичных многоклеточных агрегатов H. aquaeductus.

На 5–8 спд происходило освобождение агрегатов из окружающей их оболочки.

Эти агрегаты выглядели более плотными, имели правильную сферическую форму, но неровную поверхность (Рисунок 26В). Данную стадию реагрегации клеток можно охарактеризовать как ранние примморфы (Рисунок 28). В течение следующих двух суток следовало преобразование ранних примморфов в настоящие примморфы (Таблица 3; Рисунок 28). Оно сопровождалось формированием у агрегатов абсолютно гладкой поверхности (Рисунок 26Г). Примморфы H. panicea имели размер 700±376 мкм (n=69) (Таблица 4).

В культурах клеток, полученных от трех особей трансформация первичных многоклеточных агрегатов в ранние примморфы (а затем и в настоящие примморфы) не сопровождалась выделением вокруг них оболочки (Рисунок 28). В этих случаях формирование примморфов происходило как в ходе реагрегации клеток, которые были получены от особей H. panicea, находящихся на стадии роста, предшествующего половому размножению.

Примморфы были способны сохранять жизнеспособность в культуре в среднем до 10-11 спд (4-5 суток после формирования). Максимальная продолжительность жизни примморфов составила 23 спд (15 суток после формирования) (Таблица 2). После своего окончательного формирования примморфы не проявляли признаков дальнейшего развития.

Период эмбриогенеза. В ходе экспериментов были исследованы культуры клеток, полученные от 10 особей, которые находились на данной стадии репродуктивного цикла. В их тканях были обнаружены эмбрионы на разных этапах развития. Культуры клеток, полученные от всех особей, были жизнеспособны, и наблюдения за ними проводили более 4 спд (Таблица 2; Рисунок 29).

Во всех культурах клеток к 24 чпд происходило формирование первичных многоклеточных агрегатов размером 164±65 мкм (n=105) (Таблица 3, 4; Рисунок 29).

Форма агрегатов варьировала от округлой до сложной разветвленной (Рисунок 26А). В культурах, полученных от трех особей, которые были собраны во второй половине июля, эта стадия реагрегации была последней: первичные агрегаты в этих культурах не проявляли признаков дальнейшего развития и погибали в течение 3-5 суток (Рисунок 29).

Первичные агрегаты, полученные от остальных семи особей, к 3-5 спд вступали в процесс трансформации, и вокруг них формировалась полупрозрачная оболочка (Рисунок 26Б). Но лишь в культурах, полученных от трех особей, этот процесс закончился формированием ранних примморфов на 4-6 спд (Таблица 3; Рисунок 26В).

Первичные многоклеточные агрегаты, полученные от остальных особей, погибали в ходе процесса трансформации на 5-7 спд (Рисунок 29).

В дальнейшем ранние примморфы не развивались и формирования настоящих примморфов не наблюдали (Рисунок 29). Ранние примморфы имели размеры 534±198 мкм (n=23) и сохраняли жизнеспособность до 6-11 спд (2-5 суток после формирования) (Таблица 2, 4).

Период восстановления соматических тканей и пострепродуктивного роста. В ходе экспериментов были исследованы культуры клеток, полученные от 10 особей, которые находились на данной стадии репродуктивного цикла. Культуры клеток, полученные от всех особей, были жизнеспособны, и наблюдения проводили более 4 спд (Таблица 2; Рисунок 30).

К 24 чпд во всех культурах происходило формирование первичных многоклеточных агрегатов, имеющих размер 208±108 мкм (n=114) и форму от округлой до сложной разветвленной (Таблица 3, 4; Рисунок 26А). Однако, дальнейшего развития этих агрегатов не происходило. Многоклеточные агрегаты сохраняли жизнеспособность до 4-5 спд, после чего разрушались (Таблица 2; Рисунок 30).

3.2.4. Halisarca dujardinii

Период гаметогенеза. В ходе экспериментов были исследованы культуры клеток, полученные от девяти особей, которые находились на данной стадии репродуктивного цикла. Семь особей несли в своих тканях ооциты на разных стадиях созревания, две особи – не несли половых элементов (вероятно, это были самцы после вымета сперматозоидов). Культуры клеток, полученные от всех особей, были жизнеспособны и наблюдения за ними проводили более 9 суток (Таблица 2). В культурах клеток, полученных от самок и самцов, различий в темпе и характере реагрегации обнаружено не было.

Реагрегация клеток H. dujardinii шла гораздо активнее по сравнению с другими исследованными видами. Уже к 1 чпд в культурах формировались первичные многоклеточные агрегаты размером 74±26 мкм (n=47), имевшие округлую форму (Таблица 3, 4; Рисунок 32). Агрегаты активно сливались друг с другом, в результате чего в культурах появлялись агрегаты более сложной формы (Рисунок 31А).

Через несколько часов агрегаты становились крупнее, плотнее, и их форма приближалась к округлой. Эту стадию реагрегации клеток H. dujardinii можно охарактеризовать как ранние примморфы (Рисунок 31Б, 32).

Настоящие примморфы формировались в культурах на 1-3 спд (Таблица 3;

Рисунок 32). Они имели округлую форму и абсолютно гладкую поверхность (Рисунок 31В). Размер примморфов составлял 408±190 мкм (n=101) (Таблица 4).

В отличие от других исследованных видов примморфы H. dujardinii были способны к прогрессивному развитию. В течение следующих 9-10 суток после формирования примморфов происходило восстановление исходной организации губки (Таблица 3; Рисунок 32).

Первым признаком прогрессивного развития служило прикрепление примморфов ко дну чашек Петри (Рисунок 31Г). Это процесс происходил на 4-5 сутки во всех культурах, однако прикреплялись не все примморфы – некоторые из них оставались неприкрепленными. К дальнейшему развитию были способны как прикрепленные, так и неприкрепленные примморфы.

В культурах, полученных от семи особей, признаки дальнейшего развития примморфов проявлялись на 4-5 спд. С этого момента внутри примморфов стали заметны полости – части развивающейся водоносной системы (Рисунок 31Д). К 9-10 спд развивающиеся примморфы в этих культурах уже несли зачатки оскулюмов (Рисунок 31Е). Количество этих зачатков отличалось у прикрепленных и неприкрепленных примморфов: прикрепленные примморфы несли один зачаток оскулюма, а неприкрепленные – несколько (от 2 до 10). Зачатки оскулюмов открывались на 11-12 спд (Таблица 3; Рисунок 31Ж). У неприкрепленных примморфов всегда открывался только один из зачатков оскулюмов. После этого другие зачатки постепенно исчезали с поверхности губки.

Восстановившиеся в культурах губки были жизнеспособны. После открытия оскулюмов губки активно фильтровали воду. Также они были способны к медленному движению по субстрату, в результате чего могло происходить слияние нескольких особей в одну (Рисунок 33). К сходному движению по субстрату были способны и развивающиеся примморфы. В ходе их движения могло происходить не только слияние нескольких агрегатов в один, но и разделение одного агрегата на несколько (Рисунок 34). Кроме того, также, как и интактные губки, восстановившиеся особи были способны к медленным ритмичным сокращения как всего тела, так и его отдельных участков (Рисунок 35). Подобные сокращения наблюдали даже у еще не полностью восстановившихся особей – сокращения начинались после видимого развития водоносной системы, непосредственно перед формированием зачатков оскулюмов.

После окончательного формирования губок мы переносили их в лабораторные аквариум с естественной морской водой. В таких условиях губки сохраняли жизнеспособность более 70 суток (точное время жизни не определялось в связи с окончанием эксперимента).

В культурах, полученных от двух других особей, развитие примморфов было замедленно: полости развивающейся водоносной системы появлялись только на 15 спд, а зачатки оскулюмов – на 17-22 спд. Кроме того, мы не наблюдали полного восстановления губок в этих культурах – зачатки оскулюмов не открывались и губки не фильтровали воду (Рисунок 32).

Период эмбриогенеза. В ходе экспериментов были исследованы культуры клеток, полученные от шести особей, которые находились на данной стадии репродуктивного цикла. Три из них содержали в тканях эмбрионы на разных стадиях дроблений, три – предличинок и личинок. Культуры клеток, полученные от всех особей, были жизнеспособны, и наблюдения за ними проводили более 3 спд (Таблица 2).

В целом, реагрегация клеток особей с эмбрионами и личинками идет медленнее по сравнению с реагрегацией клеток особей, несущих гаметы (Таблица 3;

Рисунок 32, 36, 37). Кроме того, были обнаружены отличия в характере и темпе реагрегации в культурах клеток, которые были получены от особей, несущих эмбрионы, и особей, несущих предличинок и личинок (Рисунок 36, 37).

В культурах клеток, полученных от всех особей в период эмбриогенеза, первичные многоклеточные агрегаты формировались через 1 чпд (Таблица 3;

Рисунок 36, 37). Они имели размеры 65±19 мкм (n=32) и округлую или овальную форму (Таблица 4). Первичные агрегаты активно сливались друг с другом, формируя агрегаты более сложной формы. В состав агрегатов входили эмбрионы и/или отдельные бластомеры, которые лежали как на поверхности агрегатов, так и в их толще (Рисунок 38А).

К 24 чпд происходило преобразование первичных многоклеточных агрегатов в ранние примморфы (Рисунок 36, 37, 38Б). В культурах, полученных от одной из особей, которая несла в тканях эмбрионы, это была последняя стадия реагрегации. Дальнейшего прогрессивного развития ранних примморфов не происходило, и они разрушились на 3 спд (Рисунок 36).

В культурах, полученных от двух других особей, которые несли в тканях эмбрионы, на 3-6 спд формировались настоящие примморфы, которые имели размеры 345±196 мкм (n=53) (Таблица 3, 4; Рисунок 36). Непосредственно после формирования ранних примморфов эмбрионы и бластомеры, входившие в их состав, начинали концентрироваться у их поверхности, а затем выходили из ранних примморфов (Рисунок 38Б). К моменту формирования настоящих примморфов все эмбрионы и бластомеры находились вне агрегатов, и свободно лежали на дне чашек Петри (Рисунок 38В).

Примморфы были способны к прогрессивному развитию. К 3-5 спд часть примморфов прикреплялась к субстрату, и уже на 6-8 спд в них появлялись хорошо заметные полости развивающейся водоносной системы (Рисунок 31Д). Дальнейшее развитие происходило медленнее – зачатки оскулюмов формировались только на 16-17 спд, а открывались – на 18 спд (Таблица 3; Рисунок 31Е, Ж, 36). Восстановившиеся губки фильтровали воду, были способны к медленным движениям по субстрату и ритмичным сокращениям, как и губки, полученные в культурах клеток H. dujardinii в период гаметогенеза (Рисунок 33, 34, 35).

В ходе реагрегации клеток, полученных от особей, которые несли в тканях предличинок и личинок, в состав первичных многоклеточных агрегатов входили предличинки, личинки и/или их части. В культурах, полученных от двух особей, формирование примморфов происходило на 3-4 спд. В этих культурах часть примморфов прикреплялась к дну чашек Петри сразу после своего формирования. В культурах, полученных от еще одной особи, примморфы формировались только на 8-10 спд. Примморфы, полученные от этой особи, никогда не прикреплялись к субстрату (Рисунок 37).

Как и в случае с эмбрионами предличинки, личинки и/или их части выходили из состава агрегатов к моменту формирования примморфов. После выхода из агрегатов личинки были способны плавать за счет биения ресничек. Исследования живых личинок под микроскопом показали, что большинство из них были повреждены или сильно деформированы, но встречались и неповрежденные личинки. Некоторые личинки после 1-2 суток плавания оседали на дно чашек Петри и приступали к метаморфозу. Их дальнейшая судьба не была прослежена.

Дальнейшее прогрессивное развитие примморфов в культурах, полученных от особей, которые несли в тканях предличинок и личинок, было замедлено (полости появлялись только на 10-11 спд) и никогда не заканчивалось восстановлением исходной организации губки (Рисунок 37).

Ни в одной из культур, полученных от губок в период эмбриогенеза, не происходило прикрепления примморфов к дну чашек Петри.

Период восстановления соматических тканей и пострепродуктивного роста. В ходе экспериментов были исследованы культуры клеток, полученные от 28 особей, которые находились на данной стадии репродуктивного цикла. При микроскопическом обследовании живых тканей в них не было обнаружено никаких репродуктивных элементов, а также каких-либо явных отличий между особями. Культуры клеток, полученные от всех особей, были жизнеспособны, и наблюдения за ними проводили более 5 суток (Таблица 2). Тем не менее, по темпу и характеру реагрегации клеток исследованные особи четко разделялись на две группы: 1) особи, собранные в первой половине августа (11 особей) (Рисунок 39) и 2) особи, собранные во второй половине августа – начале сентября (17 особей) (Рисунок 40). Судя по всему, к первой группе относились особи, находящиеся на стадии восстановления соматических тканей после выхода личинок, а ко второй – особи на стадии пострепродуктивного роста.

В культурах, полученных от всех особей, формирование первичных многоклеточных агрегатов происходило через 1 чпд (Таблица 3; Рисунок 39, 40).

Агрегаты имели округлую форму, размеры 90±30 мкм (n=46) и активно сливались друг с другом (Таблица 4; Рисунок 31А). Преобразование первичных агрегатов в ранние примморфы происходило через 5-7 чпд (Рисунок 31Б). К 1-3 спд агрегаты приобретали округлую форму и абсолютно гладкую поверхность и становились настоящими примморфами (Таблица 3; Рисунок 31В, 39, 40). Они имели размеры 333±176 мкм (n=134). Примморфы в большинстве исследованных культур были способны к прогрессивному развитию (Таблица 4). Темп и характер прогрессивного развития примморфов различался в культурах, полученных от особей из двух групп (Рисунок 39, 40).

В культурах, полученных от четырех особей на стадии восстановления соматических тканей после выхода личинок, примморфы не прикреплялись к дну чашек Петри и не были способны к прогрессивному развитию (Рисунок 39).

В культурах, которые были получены от оставшихся семи особей на стадии восстановления соматических тканей после выхода личинок примморфы были способны к прогрессивному развитию. Часть из них прикреплялась к дну чашек Петри на 1-11 спд (Рисунок 31Г). К 5-7 спд в развивающихся примморфах становились заметны полости будущей водоносной системы (Рисунок 31Д). Однако, полное восстановление губки произошло только в культурах, полученных от одной из особей. В этих культурах зачатки оскулюмов формировались на 16 спд, а открывались – на 18 спд (Рисунок 31Е, Ж). В культурах, полученных от еще одной особи, происходило формирование зачатков оскулюмов, но они не открывались. В культурах, полученных от оставшихся пяти особей, примморфы с зачатками водоносной системы были последней стадией реагрегации (Рисунок 39).

Примморфы во всех культурах, которые были получены от 17 особей на стадии пострепродуктивного роста, были способны к прогрессивному развитию (Рисунок 40).

Часть примморфов прикреплялась к дну чашек Петри на 4-6 спд (Рисунок 31Г). Полости развивающейся водоносной системы становились заметны в примморфах на 4-7 спд (Рисунок 31Д). Зачатки оскулюмов появлялись на 9-10 спд и открывались уже на 10-13 спд (Таблица 3; Рисунок 31Е, Ж, 40). После этого восстановившиеся губки начинали фильтровать воду. Также они были способны к медленным движениям по субстрату и ритмичным сокращениям (Рисунок 33, 34, 35).

Губки, восстановившиеся в культурах клеток, сохраняли жизнеспособность более 17 суток после своего формирования (точное время жизни не определялось в связи с окончанием эксперимента) (Таблица 2).

–  –  –

Была исследована возможность прикрепления примморфов и ранних примморфов исследованных видов к различным субстратам. В ходе основных исследований реагрегации клеток (см. раздел 3.3) субстратом для прикрепления агрегатов служил пластик, из которого были изготовлены чашки Петри. В ходе дополнительных экспериментов примморфы (H. panicea и H. dujardinii) и ранние примморфы (H. aquaeductus и L. complicata) переносили на один из четырех субстратов: 1) чистое покровное стекло, 2) покровное стекло, покрытое поли-D-лизином, 3) покровное стекло, покрытое поли-L-лизином и 4) покровное стекло, покрытое желатином.

Ранние примморфы H. aquaeductus и L. complicata, а также примморфы H. panicea не прикреплялись ни к одному из предложенных субстратов. Поли-L-лизин оказывал негативное воздействие на агрегаты этих видов: после переноса на поли-L-лизином они разрушались в течение 1-2 суток.

Примморфы H. dujardinii, напротив, были способны прикрепляться ко всем предложенным субстратам, кроме поли-L-лизина (после переноса на этот субстрат примморфы H. dujardinii также разрушались в течение 1-2 суток). После прикрепления к чистому стеклу и стеклу, покрытому поли-D-лизином, примморфы были способны к прогрессивному развитию, которое заканчивалось восстановлением исходной организации губки. После прикрепления к стеклу, покрытому желатином, примморфы H. dujardinii также были способны к прогрессивному развитию, однако восстановления исходной организации не происходило. Развивающиеся примморфы погибали из-за активного размножения бактерий на желатине.

В качестве еще одного субстрата может быть рассмотрена бактериальная пленка, которая формировалась на дне чашек Петри после переноса агрегатов исследованных видов в аквариум с натуральной морской водой (см. раздел 3.5). Ранние примморфы H. aquaeductus и L. complicata были неспособны прикрепляться к этому субстрату.

Большинство примморфов H. panicea также не прикреплялись к бактериальной пленке, но примморфы, полученные от двух особей в период гаметогенеза, прикрепились к субстрату на 9-10 спд. Примморфы, полученные от всех особей H. dujardinii, прикреплялись к бактериальной пленке и были способны к прогрессивному развитию.

Исследования влияния типа субстрата на ранние этапы реагрегации клеток показали, что на чистом стекле, поли-D-лизине и желатине процесс реагрегации проходил также как в контрольных экспериментах у всех изученных видов. Поли-Lлизин оказывал негативное влияние на реагрегацию клеток всех видов – формирования первичных многоклеточных агрегатов не происходило.

3.5. Влияние переноса многоклеточных агрегатов в аквариум с естественной морской водой на их дальнейшее развитие Перенос первичных многоклеточных агрегатов всех исследованных видов в аквариум с естественной морской оказал положительное влияние на их дальнейшее развитие. Развитие агрегатов в аквариуме было ускорено относительно развития агрегатов в чашках Петри. Так, агрегаты H. panicea, H. aquaeductus и L. complicata трансформировались в ранние примморфы на 1-2 суток раньше. В случае с агрегатами H. dujardinii ускорение наблюдалось не на этапе трансформации первичных многоклеточных агрегатов в примморфы, а в ходе прогрессивного развития примморфов, и составляло 2-4 суток (в одном из случаев – 6 суток). В ряде случаев агрегаты H. panicea и H. dujardinii, культивировавшиеся в аквариуме, в своем развитии достигали более поздних стадий, по сравнению с агрегатами, которые были получены от тех же особей, но культивировались в чашках Петри.

Кроме того, было обнаружено, что в агрегатах H. dujardinii, которые были получены от особей в период гаметогенеза и культивировались в аквариуме с естественной морской водой, могут проходить некоторые стадии оогенеза, связанные, вероятно, с накоплением питательных веществ в цитоплазме ооцитов. Во время диссоциации ткани этих губок несли только мелкие незрелые яйцеклетки, однако на 9 спд в развивающихся в аквариуме примморфах были заметны крупные овальные яйцеклетки. При культивировании агрегатов, полученных от тех же особей, в чашках Петри процесса созревания яйцеклеток не происходило.

Тем не менее, даже при культивировании в аквариуме агрегаты H. panicea, H. aquaeductus и L. complicata не были способны к прогрессивному развитию и восстановлению исходной организации губки. Как и при культивировании в чашках Петри развитие агрегатов H. aquaeductus и L. complicata останавливалось на стадии ранних примморфов, а агрегатов H. panicea – на стадии примморфов (но агрегаты, полученные от двух особей в период гаметогенеза, прикрепились к субстрату на 9-10 спд).

На агрегатах H. dujardinii удалось показать, что культивирование в аквариуме оказывает положительный эффект на жизнеспособность крупных многоклеточных агрегатов размером 2-4 мм. При культивировании в чашках Петри подобные агрегаты погибали в течении нескольких первых суток после диссоциации тканей. Однако в аквариуме эти агрегаты были полностью жизнеспособны и способны к прогрессивному развитию, которое заканчивалось восстановление исходной организации губки.

–  –  –

Упаковка клеток в составе первичных многоклеточных агрегатов L. complicata неплотная, и все клетки имеют округлую форму. Агрегаты возрастом 1 спд характеризуются очень неровной поверхностью с большим количеством складок, а также наличием большого количества полостей во внутренней части (Рисунок 41А, Б, В). С увеличением возраста первичных агрегатов упаковка клеток становится плотнее, внутренние полости постепенно уменьшаются как в размере, так и в количестве, а поверхность агрегатов становится ровнее (Рисунок 41Г, Д).

Большая часть первичных многоклеточных агрегатов L. complicata несет на своей поверхности пузыри, стенка которых образована теми же клетками, что и основная часть агрегата (Рисунок 41А, Г, Е). Часто стенки пузырей образованы несколькими слоями клеток. Форма этих клеток близка к округлой (Рисунок 41А, Г). С увеличением возраста агрегатов большая часть пузырей приобретает стенки, построенные из одного слоя клеток, которые имеют трапециевидную форму, что приводило к увеличению площади контактов между соседними клетками (Рисунок 41Е). У агрегатов возрастом 3 спд многослойная стенка встречается только в основании пузырей. Содержимое пузырей не удалось визуализировать ни одним из использованных методов – они всегда выглядели пустыми (Рисунок 41А, Г).

Все клетки в составе первичных многоклеточных агрегатов имеют размеры 5-9 мкм. Среди них удается выделить только хоаноциты, которые имеют характерные черты строения (Рисунок 41Б, Е, 42). Все хоаноциты несут жгутик и воротничок из микроворсинок. В цитоплазме клеток присутствуют хорошо развитые цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулюма (шЭПР), несколько фагосом и большое количество мелких мембранных пузырьков (Рисунок 42А, В, Г). Кинетосома жгутика лежит рядом с заостренной частью ядра. От проксимальной части кинетосомы отходят корешки в сторону ядра, а от боковых частей – микротрубочки. Дополнительная центриоль лежит рядом с кинетосомой и повернута относительное нее на 90 градусов (Рисунок 42А, Б). Ядро хоаноцитов имеет характерную каплевидную форму, несет ядрышко и конденсированный хроматин, ассоциированный с внутренней стороной ядерной мембраны. Рядом с заостренной частью ядра хоаноцитов всегда присутствуют один или два аппарат Гольджи (Рисунок 42А, Б, В). Хоаноциты в составе агрегатов возрастом 3 спд и старшее несут в своей цитоплазме мембранные включения с гомогенным содержимым (Рисунок 42В, Г).

Остальные клетки в составе первичных многоклеточных агрегатов не имеют специфических черт строения, и их принадлежность к каким-либо клеточным типам установить не удалось. Все эти клетки имеют ядро округлой или неправильной формы, которое несет ядрышко и большое количеством конденсированного хроматина. В цитоплазме клеток присутствуют цистерны шЭПР, единичные фагосомы, аппарат Гольджи и мембранные везикулы различной электронной плотности (Рисунок 43). Эти клетки рассматривались нами как амебоциты.

Все клетки в составе многоклеточных агрегатов L. complicata несут в своей цитоплазме одну или две крупных электронно-прозрачных вакуоли с волокнистым содержимым и небольшими вкраплениями электронно-плотного материала (Рисунок 41Б, Е, 42, 43).

На поверхности первичных агрегатов клетки имеют округлую форму. Среди них встречаются хоаноциты, несущие жгутики и воротнички из микроворсинок (Рисунок 41Д, 44А). По своему строению клетки на поверхности не отличают от клеток внутренней части агрегата. Начиная с 3 спд на поверхности многоклеточных агрегатов появляются группы клеток полигональной формы, часть из которых уплощена (Рисунок 44Б). Вероятно, это центры эпителизации. В составе этих очагов присутствуют и хоаноциты, которые легко идентифицируются по наличию жгутика и воротничка микроворсинок.

Упаковка клеток в ранних примморфах L. complicata плотная, все клетки имеют полигональную форму. Во внутренней части примморфов отсутствуют крупные полости, хотя небольшие свободные пространства между клетками все еще присутствуют (Рисунок 45А, В). Поверхность ранних примморфов ровная и не несет впячиваний (Рисунок 46А). Если на поверхности присутствуют пузыри, то стенка их всегда образована одним слоем клеток, имеющих трапециевидную форму. С увеличением возраста ранних примморфов упаковка клеток становится более плотной.

Во внутренней части ранних примморфов появляются небольшие полости, заполненные неклеточным материалом (Рисунок 45А, Б). Вероятно, это очаги дегенерации клеток.

Клеточный состав и ультрастуруктура клеток в ранних примморфах почти не отличаются от таковых в первичных многоклеточных агрегатах (Рисунок 42, 43).

Единственное отличие – появление значительного количества мембранных включений с гомогенным содержимыми в цитоплазме хоаноцитов (Рисунок 42В, Г).

На поверхности ранних примморфов увеличивается число и размер очагов эпителизации, а клетки, входящие в их состав, приобретают более уплощенную форму.

Хоаноциты, участвующие в эпителизации, все еще несут жгутики, но частично или полностью теряют воротнички из микроворсинок (Рисунок 46Б). Тем не менее, эпителизации не охватывает всю поверхность ранних примморфов, и на ней остаются нестабильные участки, где клетки формируют большое количество псевдоподий и, вероятно, находятся в состоянии активного движения (Рисунок 46В).

Частичная или полная потеря воротничков из микроворсинок хоаноцитами на поверхности ранних примморфов L. complicata была единственным признаков дедифференцировки хоаноцитов в ходе реагрегации клеток данного вида.

Большинство хоаноцитов сохраняли характерные признаки (каплевидное ядро и жгутик, окруженный воротничков микроворсинок) на протяжении всего процесса реагрегации клеток:

полностью дифференцированные хоаноциты всегда присутствовали во внутренней части ранних примморфов (Рисунок 45В). Исследования первичных агрегатов и ранних примморфов разных возрастов методом иммуногистохимии показали, что количество хоаноцитов в агрегатах не претерпевало значительных изменений в ходе реагрегации клеток (Рисунок 47).

Помимо клеток губки в состав первичных многоклеточных агрегатов и ранних примморфов L. complicata входят бактерии палочковидной формы (Рисунок 43А, В, 44).

В составе многоклеточных агрегатов возрастом 1 спд бактерии равномерно распределены по поверхности агрегатов, а также в их внутренней части в пространствах между клетками (Рисунок 41А). Однако с увеличением возраста агрегатов количество бактерии уменьшается, а их распределение становится неравномерным. У многоклеточных агрегатов возрастом 3 спд большая часть бактерии находится в оставшихся крупных полостях во внутренней части агрегатов, а также в небольшом количестве – на поверхности (Рисунок 41Г, 44). В ходе трансформации агрегатов в ранние примморфы бактерий, находившиеся в полостях во внутренней части агрегатов, исчезают вместе с этими полостями. Вероятно, бактерии фагоцитируются клетками примморфов. В составе ранних примморфах небольшое количество бактерий сохраняется на их поверхности, а также в небольших пространствах между клетками в их внутренней части (Рисунок 46).

3.6.2. Haliclona aquaeductus

Гистологические исследования показали, что первичные многоклеточные агрегаты H. aquaeductus состоят из клеток двух размерных классов: мелкие клетки размером 2-5 мкм и крупные клетки размером 8-20 мкм. Мелкие клетки составляют большинство клеток первичных агрегатов, крупные клетки присутствуют в меньшем количестве. Клетки в агрегатах упакованы неплотно и имеют округлую форму. При электронно-микроскопических исследованиях нам не удалось обнаружить специфических межклеточных контактов. Более того, в большинстве случаев цитоплазматические мембраны соседних клеток разделяют значительные свободные пространства, и они не соприкасаются друг с другом (Рисунок 48A, B).

В ходе электронно-микроскопических исследований среди крупных клеток удалось выделить 4 типа: ядрышковые амебоциты и 3 типа клеток с включениями.

Ядрышковые амебоциты имеют крупное округлое ядро c хорошо выраженным ядрышком и равномерно распределенным слабо конденсированным хроматином. Ядро обычно занимает почти центральное положение в клетке. В цитоплазме амебоцита находятся небольшое количество цистерн шЭПР, один или два аппарата Гольджи в виде стопок диктиосом (занимают положение около ядра), а также фагосомы. Изредка в цитоплазме этих клеток встречаются единичные мембранные включения с гомогенным содержимым (Рисунок 48Г).

Клетки с включениями встречаются в агрегатах H.

aquaeductus в значительных количествах и имеют ультраструктурные отличия, которые позволяют выделить среди них три типа:

Гранулярные клетки (Рисунок 48Д). Цитоплазма практически полностью занята 1.

15-40 мембранными включениями размером 1,1±0,3 мкм. Форма включений варьирует от округлой до зерновидной. Большинство включений имеет гомогенное содержимое, но встречаются включения с мелкозернистым содержимым. Цитоплазма клеток мелкозернистая. В ней не удалось обнаружить другие органеллы. Ядро занимает периферическое положение и не имеет ядрышка, как показало исследование серийных полутонких срезов. В кариоплазме присутствует конденсированный хроматин, частично ассоциированный с внутренней поверхностью ядерной мембраны.

Сферульные клетки (Рисунок 48Е). В цитоплазме находится 5-15 крупных 2.

(2,12±0,44 мкм) округлых мембранных включений с гомогенным содержимым. Также изредка встречаются мембранные включения с мелкозернистым содержимым. В цитоплазме присутствует большое количество цистерн шЭПР и электронно-прозрачных везикул. Иногда в цитоплазме этого типа клеток встречаются единичные фагосомы.

Ядро клетки округлое, несет ядрышко. Хроматин в нем распределен равномерно. Около ядра обычно располагаются несколько аппаратов Гольджи в виде стопок диктиосом.

Спонгоциты (Рисунок 48Е). Клетки этого типа несут 7-10 округлых включений, 3.

окруженных мембраной. Размер этих включений составляет 1,08±0,24 мкм.

Большинство из них имеет гомогенной содержимое, некоторые – мелкозернистое. В цитоплазме клетки присутствует большое количество цистерн шЭПР. Также в цитоплазме удается обнаружить электронно-прозрачные везикулы и фагосомы. Ядро округлое, имеет ядрышко, в кариоплазме присутствует небольшое количество конденсированного хроматина. Около ядра лежит аппарат Гольджи. Тем не менее, у этих клеток отсутствует ряд признаков, характерных для интактных спонгоцитов (например, поляризация и определенное положение в теле губки).

Большинство мелких клеток к 1 спд теряют характерные признаки и выглядят дедифференцированными. Они имеют зернистую, иногда темную, цитоплазму. Ядро чаще не имеет ядрышка. В цитоплазме есть небольшое количество цистерн шЭПР, а также электронно-прозрачные и электронно-непрозрачные включения.

Тем не менее, среди мелких клеток удается выделить хоаноциты. Эти клетки имеют округлую форму, несут жгутик и воротничок из микроворсинок. Кинетосома жгутика всегда лежит в противоположной от ядра части клетки. Корешкового аппарата кинетосомы обнаружить не удалось. Ядро хоаноцитов округлое, не имеет ядрышка, в нем присутствует конденсированный хроматин, ассоциированный с внутренней поверхностью ядерной мембраны. В цитоплазме некоторых хоаноцитов лежат 1-2 фагосомы и единичные включения с гомогенным содержимым (Рисунок 48З).

Количество хоаноцитов значительно в агрегатах возрастом 1 спд, но уже в агрегатах возрастом 3 спд удается обнаружить лишь единичные клетки этого типа. В агрегатах бльшего возраста хоаноциты не обнаружены.

Процесс трансформации многоклеточных агрегатов в ранние примморфы сопровождается выделением из агрегатов рыхлого материала, состоящего из мертвых клеток и дебриса, что приводит к образованию вокруг агрегатов оболочки (Рисунок 25Б, 48Б).

На гистологическом уровне трансформация первичных многоклеточных агрегатов в ранние примморфы сопровождается значительными изменениями в их строение. Во-первых, ранние примморфы состоят только из ядрышковых амебоцитов и гранулярных клеток. Остальные типы клеток исчезают в ходе трансформации.

Оставшиеся клетки приобретают полигональную форму, и теперь их не разделяют такие значительные пространства как в составе первичных клеточных агрегатов. В большинстве случаев цитоплазматические мембраны соседних клеток лежат параллельно друг другу, разделенные небольшим свободным пространством, постоянной ширины. Между клетками отсутствуют межклеточные контакты, характерные для тканей Eumetazoa (Рисунок 49Г, Е).

Во-вторых, в ранних примморфах происходит формирование трех концентрических зон клеток (Рисунок 49А, Б). Электронно-микроскопические исследования показали, что поверхностная зона состоит из клеток разнообразной формы, несущих псевдоподии. Некоторые из этих клеток имеют слегка уплощенную форму. В этой зоне отсутствуют тяжи внеклеточного матрикса (Рисунок 49В, Г, Е).

Промежуточная зона состоит из плотно упакованных клеток, между которыми присутствуют тяжи внеклеточного матрикса (Рисунок 49Д, Е). В центральной зоне упаковка клеток очень неплотная, большинство клеток имеет округлую форму, и между ними присутствует значительное количество тяжей внеклеточного матрикса (Рисунок 49Ж).

В дальнейшем на поверхности ранних примморфов появляются отдельные экзопинакоциты.

Тем не менее, они не формируют сплошного слоя на поверхности:

встречаются лишь отдельные экзопинакоциты, большая часть клеток поверхности сохраняет амебоидную форму и несет большое количество сильно разветвленных псевдоподий (Рисунок 49З).

3.6.3. Halichondria panicea

Гистологические исследования показали, что первичные многоклеточные агрегаты H. panicea, также как и первичные агрегаты H. aquaeductus, состоят из клеток двух размерных классов – мелких (2-5 мкм) и крупных (8-20 мкм). Большая часть клеток в составе агрегатов имеет размеры 2-5 мкм. Также в составе агрегата наблюдаются скопления клеточного дебриса, которые формируется в результате гибели части клеток.

Упаковка клеток в составе первичных многоклеточных агрегатах очень неплотная, и клетки разделены значительными свободными пространствами. Нам не удалось обнаружить между клетками специфических межклеточных контактов (Рисунок 50А, Б).

Электронно-микроскопические исследования позволили выделить два типа крупных клеток: ядрышковые амебоциты и гранулярные клетки. Ядрышковые амебоциты H. panicea по своему строению схожи с амебоцитами H. aquaeductus (Рисунок 50В). По мере увеличения возраста многоклеточных агрегатов количество фагосом в амебоцитах увеличивается.

Гранулярные клетки несут в своей цитоплазме 10-20 гомогенных мембранных включений размером 0,57±0,10 мкм, а также довольно крупные цистерны шЭПР. Ядро этих клеток имеет округлую форму и несет ядрышко. Хроматин в ядре распределен равномерно (Рисунок 50Г).

Как и в многоклеточных агрегатах H. aquaeductus, большинство мелких клеток в составе агрегатов теряют характерные признаки и выглядят H. panicea дедифференцированными (Рисунок 50Д). Среди них удается выделить лишь хоаноциты, потому что они несут жгутик и воротничок из микроворсинок. В целом, хоаноциты H. panicea имеют строение сходное с хоаноцитами H. aquaeductus, однако присутствуют два отличия: 1) у хоаноцитов H. panicea кинетосома жгутика лежит очень близко к ядру и в некоторых случаях вызывает изменение формы ядра, 2) хоаноциты H. panicea имеют не округлую, а уплощенную форму (Рисунок 50Е).

Трансформация первичных многоклеточных агрегатов H. panicea в ранние примморфы проходит сходно с данным процессом у агрегатов H. aquaeductus. В ходе трансформации вокруг агрегатов формируется оболочка из мертвых клеток и клеточного дебриса, большая часть типов клеток исчезает и возрастает плотность упаковки оставшихся клеток (Рисунок 51А).

Электронно-микроскопические исследования показали, что ранние примморфы H. panicea состоят только из ядрышковых амебоцитов. В целом, их строение не отличается от амебоцитов в первичных агрегатах, но они несут больше фагосом, и у многих из них деформированы ядра, вероятно вследствие повышения плотности упаковки клеток. Кроме того, внутри ранних примморфов H. panicea формируются три концентрические зоны клеток, имеющие сходное строения с таковы в ранних примморфах H. aquaeductus (Рисунок 51А, Б).

–  –  –

полностью дифференцированные хоаноциты H. panicea присутствовали только на ранних этапах данного процесса. Как показали иммуногистохимические исследования, по мере увеличения возраста агрегатов количество дифференцированных хоаноцитов в их составе уменьшалось: в состав первичных агрегатов возрастом 24 чпд входило множество дифференцированных хоаноцитов, в состав первичных агрегатов возрастом 3 спд – лишь единичные хоаноциты, в составе ранних примморфов дифференцированные хоаноциты отсутствовали (Рисунок 52). Основная часть дифференцированных хоаноцитов исчезала в ходе трансформации первичных многоклеточных агрегатов в ранние примморфы. Возможно, хоаноциты выбрасываться из агрегатов в ходе формирования оболочки из мертвых клеток и клеточного дебриса или фагоцитируются, оставшимися в составе агрегатов, амебоцитами. Также возможна трансдифференцировка хоаноцитов в амебоциты, но промежуточные стадии этого процесса обнаружены не были.

В ходе дальнейшего развития ранние примморфы преобразуются в настоящие примморфы, что сопровождается формированием сплошного слоя экзопинакоцитов на их поверхности (Рисунок 51В). Поскольку ранние примморфы H. panicea состоят, судя по всему, только из ядрышковых амебоцитов, именно эти клетки преобразуются в экзопинакоциты. В остальных чертах своего строение настоящие примморфы сходны с ранними примморфами.

3.6.4. Halisarca dujardinii

Гистологические исследования показали, что первичные многоклеточные агрегаты H. dujardinii состоят из неплотно упакованных клеток размером 10-20 мкм. Все клетки активно образуют псевдоподии и, судя по их форме, находятся в процессе активного движения (Рисунок 53A).

На электронно-микроскопическом уровне удалось выделить несколько типов клеток в составе первичных многоклеточных агрегатов:

Ядрышковые амебоциты (Рисунок 53Б). Ядро, несущее ядрышко, обычно 1.

занимает почти центральное положение в клетке и содержит гомогенный хроматин.

Около ядра находятся 1-3 аппарата Гольджи в виде стопок диктиосом. Цитоплазма богата разнообразными органеллами: многочисленными электронно-прозрачными везикулами, цистернами шЭПР, отдельными гомогенными электронно-плотными включениями и единичными фагосомами. Также в цитоплазме обнаруживаются немногочисленные митохондрии.

Хоаноциты (Рисунок 53В). Клетки имеют неправильную форму и несут жгутик, 2.

окруженный воротничком микроворсинок. Отличительной особенностью хоаноцитов является их ядро – оно имеет каплевидную форму, несет ядрышко и конденсированный хроматин, ассоциированный с внутренней стороной ядерной мембраны. Кинетосома жгутика лежит около заостренной части ядра, и от ее проксимальной части в сторону ядра идут корешки. Рядом с кинетосомой находится дополнительная центриоль.

Аппарат Гольджи на срезах представлен двумя стопками диктиосом, лежащими с двух сторон от узкой части ядра. В цитоплазме хоаноцитов встречаются гомогенные включения, электронно-прозрачные везикулы, фагосомы, небольшое количество цистерн шЭПР и митохондрии.

Сферульные клетки (Рисунок 53Г). Цитоплазма этих клеток почти полностью 3.

занята 3-5 очень крупными включениями с гомогенным содержимым. Форма включений варьирует от округлой до полигональной, а их размер составляет 3,14±0,64 мкм. Ядро сферульных клеток, несущее ядрышко, смещено на периферию и часто деформировано включениями. В небольших участках свободной от включений цитоплазмы находятся цистерны шЭПР и электронно-прозрачные везикулы.

Гранулярные клетки (Рисунок 53Д). В своей цитоплазме данный тип клеток несет 4.

5-10 мембранных включений округлой или зерновидной формы, размер которых 1,05±0,44 мкм. Большинство включений имеет гомогенное содержимое, но встречаются включения с мелкозернистым содержимым. Свободная от включения цитоплазма содержит крупные цистерны шЭПР, везикулы разной электронной плотности и ядро с ядрышком, около которого лежит аппарат Гольджи.

Микрогранулярные клетки (Рисунок 53Е). Эти клетки содержат в своей 5.

цитоплазме очень большое количество мелких мембранных включений. Средний размер включений составляет 0,33±0,04 мкм. Включения имеют округлую или овальную форму. Кроме них в цитоплазме микрогранулярных клеток обнаруживаются везикулы разной электронной плотности, цистерны шЭПР и, изредка, фагосомы. Ядро клеток обычно занимает центральное положение и имеет ядрышко.

Помимо клеток самой губки в составе агрегатов присутствует небольшое количество бактерий. Эти бактерии имеют спиральную форму и находятся в межклеточных пространствах во внутренней части агрегатов.

Основную часть клеток агрегатов составляют хоаноциты и ядрышковые амебоциты. Иммуногистохимические исследования показали, что количество хоаноцитов изменяется по мере развития агрегатов. Количество хоаноцитов резко уменьшается при трансформации первичных многоклеточных агрегатов в ранние примморфы и примморфы, что сходно с судьбой этих клеток в многоклеточных агрегатах H. panicea (Рисунок 54А, Б, В). Однако хоаноциты H. dujardinii претерпевают дедифференцировку, в результате которой постепенно теряют характерные признаки и становятся неотличимы от ядрышковых амебоцитов. Хотя небольшое число хоаноцитов сохраняет характерные признаки (каплевидная форма ядра, жгутик и воротничок из микроворсинок) в составе примморфов до 2-3 спд, большая часть этих клеток начинают дедифференцироваться уже в самом начале формирования ранних примморфов (5-7 чпд). В ходе этой дедифференцировки хоаноциты проходят стадию, когда в их цитоплазме появляются мелкие электронно-плотные включения (Рисунок 55). Данные включения не многочисленны и равномерно распределены по цитоплазме клетки. На ранних стадиях дедифференцировки электронно-плотные включения встречаются в клетках, которые все еще обладают характерными признаками хоаноцитов В дальнейшем электронно-плотные включения становятся (Рисунок 55А).

единственным отличительным признаком дедифференцирующихся хоаноцитов и позволяют прослеживать судьбу хоаноцитов вплоть до 6-7 спд, но только на электронномикроскопическом уровне (Рисунок 55Б).

В ходе прогрессивного развития примморфов количество хоаноцитов снова резко возрастает на финальных этапах восстановления исходной организации губки, когда происходит окончательная дифференцировка клеток в составе зачатков хоаноцитных камер (подробнее см. ниже) (Рисунок 54Г, Д).

Помимо изменения количества хоаноцитов, в ходе трансформации первичных многоклеточных агрегатов H. dujardinii в примморфы происходит эпителизация поверхностного слоя клеток. Электронно-микроскопические исследования показали, что поверхность первичных многоклеточных агрегатов покрывают клетки амебоидной формы, несущие большое количество псевдоподий (Рисунок 56А). Вероятно, эти клетки находятся в состояние активного движения. Среди поверхностных клеток встречаются хоаноциты, находящиеся в процессе трансдифференцировки в экзопинакоциты. Их удается выделить благодаря наличию жгутика и воротничка микроворсинок. Но даже у агрегатов возрастом 1 чпд хоаноциты, находящиеся на поверхности, имеют укороченные микроворсинки в воротничке (Рисунок 56Б). К 3 чпд поверхностные хоаноциты теряют жгутик и несут только воротничок из укороченных микроворсинок (Рисунок 56В). В ходе преобразования первичных агрегатов в ранние примморфы (5-7 чпд) на их поверхности начинают появляться первые уплощенные клетки, которые затем покрывают почти всю поверхность агрегатов. Однако это еще не стабильный слой экзопинакоцитов – большинство клеток формирует большое количество псевдоподий (Рисунок 56Г). Кроме того, эти клетки имеют веретеновидную форму, а не Т-образную как экзопинакоциты интактной губки (Рисунок 56Д). На этой стадии трансдифференцирующиеся хоаноциты уже неотличимы от других клеток.

Окончательная эпителизация агрегатов происходит при преобразование ранних примморфов в настоящие примморфы на 1-3 спд (Рисунок 56Е). Гистологические исследования показали, что к этому времени часть экзопинакоцитов начинает принимать Т-образную форму. Во внутренней части примморфов происходит незначительное уплотнение упаковки клеток. Между ними остаются свободные пространства, заполненные многочисленными отростками клеток, но многие клетки приобретают полигональную форму (Рисунок 58А). У агрегатов H. dujardinii преобразование в примморфы не сопровождается выделением оболочки из мертвых клеток и клеточного дебриса, и исчезновением каких-либо типов клеток.

Примморфы H. dujardinii способны к прогрессивному развитию, которое заканчивается формирование функциональной и жизнеспособной особи. На гистологическом уровне это развитие проявляется в постепенном возникновении структур характерных для интактной губки – каналов водоносной системы, хоаноцитных камер, мезохила и т.д. (Рисунок 57).

Одновременно с полной эпителизацией агрегатов происходит формирование первых зачатков каналов водоносной системы. Эти зачатки представляют собой небольшие полости между клетками, у которых пока отсутствует выстилка из эндопинакоцитов. В некоторых полостях присутствует клеточный материал - вероятно, это псевдоподии клеток, окружающих эти полости (Рисунок 57, 58Б). В целом, активное образование псевдоподий всеми клетками является характерной чертой данного этапа развития примморфов H. dujardinii.

К 5-7 спд на гистологических срезах развивающихся примморфов появляются многочисленные зачатки хоаноцитных камер, которые выглядят как плотные розетки клеток. Клетки в составе этих зачатков имеют столбчатую форму, с радиально ориентированной длинной осью (Рисунок 54Г, Г). ЭлектронноВ, микроскопические исследования показали, что клетки в зачатках хоаноцитных камер несут ядро с ядрышком и большое количество фагосом в своей цитоплазме (Рисунок 59А). Данные клетки возникают либо из амебоцитов, либо из хоаноцитов (хоаноциты к этому времени теряют каплевидную форму ядра и мелкие электронноплотные включения, что не позволяет достоверно отличить их от амебоцитов). Затем клетки начинают дифференцироваться в хоаноциты и постепенно приобретают признаки, характерные для этого типа клеток: каплевидное ядро, стопки диктиосом аппарата Гольджи с двух сторон от узкой части ядра, а также жгутик и микроворсинки, которые смотрят в полость в центральной части зачатка (Рисунок 59Б, В).

К этому времени зачатки каналов водоносной системы увеличиваются в размерах и приобретают выстилку из эндопинакоцитов (Рисунок 57, 58Г). Эндопинакоциты имеют либо веретеновидную форму, либо их центральная часть немного погружена в мезохил (Рисунок 59Г). В цитоплазме этих клеток лежит ядро с ядрышком, аппарат Гольджи, цистерны шЭПР и единичные гомогенные включения. На стороне, обращенной в сторону мезохила, эндопинакоциты несут короткие псевдоподии.

Экзопинакодерма также претерпевает изменения – большинство экзопинакоцитов принимает Т-образную форму. Кроме того, под экзопинакодермой формируется поддерживающий фибриллярный слой (Рисунок 58Д).

Весь остальной объем агрегата представляет собой развивающийся мезохил будущей губки. На гистологическом уровне в мезохиле также происходят значительные структурные изменения по сравнению с предыдущими стадиями развития. Эти изменения связаны с резким уменьшением плотности упаковки клеток: в мезохиле остается лишь небольшое количество клеток, а его основной объем составляет вновь синтезированный фибриллярный внеклеточный матрикс. Первые волокна матрикса появляются на 4-5 спд. На этой стадии матрикс, в основном, сосредоточен под слоем экзопинакодермы, и лишь не значительное количество присутствует между клетками во внутренних частях примморфов. В дальнейшем количество фибриллярного матрикса увеличивается как под экзопинакодермой, так и во внутренних частях примморфов. За синтез внеклеточного матрикса, скорее всего, отвечают лофоциты. Этот тип клеток был обнаружен в развивающихся примморфах, но в единичных количествах (Рисунок 59Д).

Также в мезохиле значительно увеличивается количество клеток с включениями (особенно микрогранулярных клеток), но встречаются и немногочисленные амебоциты (Рисунок 59Г).

К 9-10 спд в структуре развивающегося примморфа появляются многие черты характерные для интактной особи (Рисунок 57):

водоносная система хорошо развита – весь объем развивающегося примморфа 1) пронизан сетью больших и малых каналов с эндопинакоцитной выстилкой, появляются первые полностью развитые хоаноцитные камеры, имеющие просвет и состоящие из дифференцированных хоаноцитов с жгутиком и воротничком микроворсинок (Рисунок 54Д, 58Е, Ж, 59Е);

в мезохиле еще больше увеличивается количество внеклеточного матрикса и 2) уменьшается количество свободных клеток, среди которых появляются единичные вакуолярные клетки (Рисунок 59Ж);

под экзопинакодермой появляется мощный слой из коллагеновых волокон, 3) экзопинакоциты приобретают Т-образную форму, и в экзопинакодерме появляются остии (Рисунок 58З, И).

В это же время начинается формирование зачатков оскулюмов. После их открытия губка имеет полностью сформированную и функциональную водоносную системы и начинает активно фильтровать воду.

–  –  –

Несмотря на более чем столетнюю историю изучения реагрегации клеток губок многие детали протекания этого процесса остаются неясными. Центральным остается вопрос о способности восстанавливать исходную организацию в ходе реагрегации клеток у разных видов губок: является ли эта способность универсальной чертой всех представителей типа Porifera или эта черта присуща лишь некоторым видам, которые имеют какие-либо особенности строения и/или биологии?

Учитывая, что чрезвычайно высокая пластичность анатомических и клеточных структур является определяющей чертой организации всех представителей типа Porifera (подробнее см. раздел 1.1.4), кажется очевидным, что все губки должны быть способны восстанавливать исходную организацию в процессе реагрегации клеток. Однако к настоящему моменту реагрегация клеток была изучена у более чем 40 видов губок, относящихся к классам Calcarea и Demospongiae, при этом почти каждый из изученных видов демонстрировал уникальный характер протекания реагрегации клеток, которая далеко не всегда заканчивалась восстановлением исходной организации. Особенности протекания реагрегации могут проявляться на любом из этапов этого процесса, начиная с особенностей поведения клеток в суспензии и заканчивая способом формирования будущих хоаноцитных камер при восстановлении исходной организации животного.

Результаты исследования динамики реагрегации клеток у четырех видов морских губок, полученные в настоящей работе, подтверждают, что существует значительная межвидовая вариабельность в протекании процесса реагрегации. В тоже время, эти результаты позволяют выявить общие черты в протекании этого процесса у всех изученных на данный момент видов губок, что дало нам возможность провести детальный анализ процесса реагрегации клеток и впервые составить общую схему протекания данного процесса у губок. Кроме того, детальное исследование динамики реагрегации клеток H. panicea и H. dujardinii на разных стадиях репродуктивных циклов этих видов позволило выдвинуть предположения относительно причин внутривидовой вариабельности протекания процесса реагрегации. Дальнейшие гистологические, иммуногистохимические и ультраструктурные исследования строения многоклеточных агрегатов изученных нами видов дали возможность детально описать морфогенезы, происходящих при развитии агрегатов, и проследить судьбу некоторых типов клеток в ходе процесса реагрегации.

–  –  –

После диссоциации тканей изолированные клетки всех изученных на настоящий момент видов губок (включая виды, изученные в настоящей работе) начинают активно формировать псевдоподии (Языков, 1965а, б; Ефремова, Дроздов, 1970; Ефремова, 1972;

Короткова, 1972а; Никитин, 1973а; Волкова, Золотарева, 1981; Wilson, 1907;

Huxley, 1912; Galtsoff, 1923, 1925a; Noble, Peterson, 1972; Gaino et al., 1985, 1993; Gaino, Burlando, 1990; Gaino, Magnino, 1999). В некоторых случаях было показано, что псевдоподии формируют только определенные типы клеток (амебоциты), тогда как другие типы (хоаноциты и/или пинакоциты) не обладают этой способностью или обладают в меньшей степени (Языков, 1965а; Ефремова, Дроздов, 1970; Ефремова, 1972;

Короткова, 1972а; Никитин, 1973а; Mookerjee, Ganguly, 1964; Gaino, Magnino, 1999).

Кроме того, на суспензии клеток E. fluviatilis было показано, что разные типы клеток проявляют максимальную псевдоподиальную активность через разные промежутки времени после момента диссоциации тканей губки. Так, ядрышковые амебоциты активно формируют псевдоподий уже через 15 минут после диссоциации, а хоаноциты

– лишь через 1 час (Ефремова, Дроздов, 1970). У изученных нами видов ярких отличий в характере псевдоподиальной активности у разных типов клеток обнаружено не было.

Однако клетки H. dujardinii изменяли тип формируемых псевдоподий после вхождения в состав первых многоклеточных агрегатов.

Поведение клеток изученных нами видов губок после оседания на субстрат является необычным. В большинстве случаев, все или хотя бы некоторые типы клеток проявляют амебоидную подвижность, а встречи таких подвижных клеток обеспечивают формирование первых многоклеточных агрегатов и их последующее увеличение в размерах (Языков, 1965а, б; Ефремова, Дроздов, 1970; Ефремова, 1972;

Короткова, 1972а; Wilson, 1907; Huxley, 1912; Galtsoff, 1923, 1925a; Mookerjee, Ganguly, 1964; Noble, Peterson, 1972; Gaino et al., 1985, 1993; Gaino, Burlando, 1990; Gaino, Magnino, 1999). В наших экспериментах при оседании на субстрат клетки всех изученных видов не проявляли амебоидной подвижности и использовали свои псевдоподии только для обследования окружающего пространства, а объединение клеток в группы происходило только в случае контакта псевдоподий соседних клеток.

Единственными подвижными клетками в суспензиях всех изученных видов были хоаноциты, но они двигались не за счет псевдоподий, а за счет биения жгутика.

Судя по всему, для изолированных клеток H. dujardinii наблюдаемое нами поведение является характерным, так как было также описано Волковой и Золотаревой (1981). Однако ряд исследований указывает, что клетки L. complicata и H. panicea, а также Haliclona cinerea (Grant, 1826) (близкородственный вид для H. aquaeductus) способны к активному амебоидному движению после оседания на субстрат (Языков, 1965а; Короткова, 1972а). Вероятно, поведение клеток губок в суспензии может меняться в зависимости от условий диссоциации и дальнейшего культивирования.

Эти факты позволяют выдвинуть предположение, что поведение клеток может меняться в ходе их реагрегации. Так, если клетки были не способны к амебоидному движению в суспензии, это не означает, что они неподвижны в составе агрегатов.

Постоянное движение клеток в теле является основой организации губок (Harris, 1987;

Bond, Harris, 1988; Gaino, Burlando, 1990; Gaino, Magnino, 1999). Но в ходе диссоциации тканей клетки теряют характерное для них микроокружение и вступают в контакт с неестественными для них субстратами (в случае наших экспериментов, с пластиком и стеклом). Все это может быть причиной изменения поведения клеток, которые теряют способность к амебоидному движению в суспензии. После объединения клеток в многоклеточные агрегаты и в ходе последующего развития агрегатов, микроокружение клеток начинает постепенно приближается к нормальному состоянию, и к клеткам может возвращается способность к движению. Изменения в поведении клеток после их объединения в агрегаты хорошо заметно в случае с клетками H. dujardinii – одиночные клетки этого вида формируют филоподии, но после объединения в агрегаты начинают формировать лобоподии. Тем не менее, для подтверждения предположения о том, что к клеткам возвращается способность к движению после объединения в многоклеточные агрегаты, необходимы тщательные прижизненные наблюдения за поведением клеток в составе агрегатов с использованием методов цейтраферной видеосъемки. В настоящий момент на подвижность клеток в составе агрегатов изученных видов губок указывают гистологические и ультраструктурные исследования, которые позволили обнаружить клетки, форма которых характерна для подвижных клеток.

Поскольку клетки изученных видов губок не обладали амебоидной подвижностью, а использовали псевдоподии для обследования пространства вокруг себя, то для успешного протекания процесса реагрегации клетки должны быть расположены достаточно близко друг другу, чтобы был возможен контакт между их псевдоподиями. В тоже время размер первичных многоклеточных агрегатов является крайне важным параметром для последующего протекания реагрегации, так как мелкие агрегаты неспособны к прогрессивному развитию, как было показано для агрегатов E. fluviatilis (Mller, 1911; Brien, 1937), C. prolifera (Galtsoff, 1925b; Bagby, 1972) и S.

lingua (Короткова, 1972а). Эти факты определили сделанный нами выбор метода диссоциации тканей и условий раннего культивирования получаемых суспензий клеток.

Поскольку метод диссоциации не оказывал заметного влияние на состояние и поведение клеток в суспензии, в качестве основного был выбран механический – наиболее быстрый метод, позволяющий получить высокие концентрации клеток в суспензиях. С помощью химического метода диссоциации тканей удавалось получать только суспензии с низкой концентрацией клеток. Вероятно, это связано с тем, что при отсутствие достаточного механического воздействия, многие клетки оставались связаны со скелетными элементами губки и не переходили в суспензию. Еще одним минусом как химического, так и механо-химического методов является присутствие ЭДТА в растворе CMFSW-E.

На суспензиях E. fluviatilis было показано, что длительным контакт с ЭДТА оказывает на клетки токсический эффект (De Sutter, Van de Vyver, 1977). В связи с этим суспензии клеток исследованных видов тщательно отмывали от остатков ЭДТА, что значительно удлиняло и усложняло химический и механо-химический методы диссоциации тканей.

При использовании всех методов диссоциации тканей мы наблюдали в суспензиях клеток группы недиссоциировавших хоаноцитов. Скорее всего, это объясняется тем, что хоаноциты в составе камер связаны друг с другом более крепко по сравнению с другими клетками в теле губок. Так, снаружи хоаноцитные камеры окружены слоем внеклеточного матрикса, который служит механической опорой для хоаноцитов. Хоаноциты заякорены в этом внеклеточном матриксе благодаря множеству коротких псевдоподий, отходящих от их базальной поверхности. Более того, псевдоподии соседних клеток могут переплетаться друг с другом, обеспечивая тесную связь этих клеток (это особенно характерно для представителей семейства Halisarcidae) (Boury-Esnault et al., 1984; Vacelet et al., 1989; Gonobooleva, Maldonado, 2009;

Ereskovsky, 2010). Также соседние хоаноциты связаны посредством межклеточных контактов, которые располагаются в средней или базальной части клеток. У большинства губок эти контакты представляют собой локальные сближения мембран соседних клеток (Gonobobleva, Maldonado, 2009; Ereskovsky, 2010), но у ряда представителей отрядов Homoscleromorpha и Calcarea между хоаноцитами описаны десмосомо-подобные межклеточные контакты (Eerkes-Medrano, Leys, 2003; Ereskovsky, Tokina, 2007).

На ранних этапах реагрегации суспензии клеток, полученные механическим методом диссоциации, культивировали на орбитальном шейкере, что приводило к временному увеличению концентрации клеток. Комбинация механического метода диссоциации тканей и культивирования суспензий клеток на орбитальном шейкере позволила увеличить вероятность контактов между клетками и размер формирующихся первичных многоклеточных агрегатов.

Несмотря на практически одинаковую концентрацию клеток в суспензиях всех изученных видов, клетки H. dujardinii реагрегировали значительно быстрее по сравнению с клетками других видов. В первую очередь, это выражалось в очень быстром формировании первичных многоклеточных агрегатов в культурах данного вида.

Поэтому время культивирования суспензий клеток H. dujardinii на орбитальном шейкере было очень коротким. Для всех исследованных видов время культивирования суспензий клеток на орбитальном шейкере было подобрано таким образом, чтобы в культурах формировались первичные многоклеточные агрегаты сходных размеров, но не происходило формирования очень крупных (более нескольких миллиметров в диаметре) агрегатов. При культивировании в чашках Петри эти крупные агрегаты были нежизнеспособны, что, вероятно, связано с недостаточным количеством кислорода в относительно небольшом объеме среды культивации. Увеличение объема среды культивирования положительно отражалось на жизнеспособности крупных многоклеточных агрегатов H. dujardinii – они не только долгое время сохраняли жизнеспособность, но и были способны к прогрессивному развитию, которое заканчивалось восстановлением исходной организации губки.

В настоящий момент сложно определить, какой именно механизм ответственен за высокую скорость реагрегации клеток H. dujardinii. Возможными механизмами могут быть либо формирование клетками бльшего количества псевдоподий, либо формирование клетками более длинных псевдоподий. В обоих случаях это увеличивает вероятность контактов между клетками, а значит и скорость их реагрегации.

На суспензиях клеток Borojevia cerebrum (Haeckel, 1872) было показано, что субстрат может оказывать воздействие на поведение клеток в суспензии и на скорость процесса реагрегации, замедляя или ускоряя его (Gaino, Magnino, 1999). Среди исследованных нами субстратов только поли-L-лизин влиял на ранние этапы реагрегации клеток, полностью препятствуя формированию агрегатов у всех изученных видов. Вероятно, это связано с тем, что поли-L-лизин оказывал токсический эффект на клетки губок. Поли-L-лизин также способен ингибировать рост в культуре широкого спектра как грам-положительных, так и грам-отрицательных бактерий, а также некоторых штаммов дрожжей (Shima et al., 1984). В тоже время показано, что клетки Haliclona sp. (кл. Demospongiae) и синцитиальные ткани Rhabdocalyptus dawsoni (Lambe, 1893) (кл. Hexactinellida) способны прикреплять к поли-L-лизину и долгое время сохранять жизнедеятельность (Leys, 1997). К сожалению, нам не удалось найти в литературе описания механизма негативного влияния поли-L-лизина на жизнедеятельность упомянутых выше организмов. Можно лишь предположить, что в условиях экспериментов происходит постепенный распад поли-L-лизина с выделением в культуральную среду L-лизина. Поскольку L-лизин, в отличии от D-лизина, может метаболизироваться живыми организмами и включаться в состав их белков, его высокие концентрации в культуральной среде могут каким-то образом негативно отражаться на жизнедеятельности организмов.

–  –  –

4.2.1. Общая схема протекания процесса реагрегации клеток В целом, реагрегация клеток всех изученных на данный момент видов губок проходит сходным образом. В ходе этого процесса многоклеточные агрегаты проходят одни и те же стадии развития. Однако в протекании реагрегации клеток удается выявить видоспецифичные черты. В первую очередь, вариации касаются скорости протекания процесса и его завершающей стадии. Реагрегация клеток большинства изученных на данный момент видов останавливается на стадии примморфов, у ряда видов остановка процесса происходит раньше – на стадии первичных многоклеточных агрегатов и лишь реагрегация клеток некоторых видов приводит к восстановлению исходной организации животного (Таблица 5).

Изученные нами виды различаются по скорости протекания реагрегации клеток.

Так, скорости реагрегации клеток у трех изученных видов (L. complicata, H. panicea и H. aquaeductus) близки, но в суспензиях клеток H. dujardinii процесс проходит заметно быстрее. Кроме того, у изученных видов отличались финальные стадии реагрегации: у L. complicata и H. aquaeductus реагрегация завершалась на стадии ранних примморфов, у H. panicea – на стадии примморфов, а у H. dujardinii – происходило восстановление исходной организации животного.

Полученные нами данные в совокупности с данными, полученными другими исследователями (подробнее см. разделы 1.2.4 и 1.2.8), указывают, что стадия, на которой происходит остановка процесса реагрегации клеток у конкретного вида губок, не определяется систематическим положением этого вида (Таблица 5). Тем не менее, некоторые особенности экологии и строения губки, судя по всему, могут влиять на протекание процесса реагрегации клеток и, в том числе, на завершающую стадию этого процесса (Valisano et al., 2006a).

Общие и видоспецифичные черты в протекании процесса реагрегации позволили Валисано и коллегами (Valisano et al., 2006a) составить общую схему протекания данного процесса у губок на основании изучения его у 21 вида средиземноморских губок. Динамика реагрегации клеток изученных нами видов вписывается в эту схему. В соответствии со схемой все изученные нами виды характеризуют быстрым формированием примморфов, долгоживущими культурами примморфов и слиянием примморфов после их формирования (Рисунок 14).

Однако схема Валисано и коллег (Valisano et al., 2006a) (Рисунок 14), судя по всему, была составлена преимущественно на основе данных, полученных самими авторами, и в ней не были учтены результаты многих исследований реагрегации клеток, выполненных в начале и середине XX века. Кроме того, эта схема явно не учитывает некоторых особенностей протекания процесса реагрегации, которые присутствуют у изученных нами видов, а также у видов, изученных рядом исследователей в последние годы (Eerkes-Medrano et al., 2014; Ereskovsky et al., 2016; Lavrov, Kosevich, 2016).

В первую очередь, в схеме Валисано и коллег по какой-то причине первичные многоклеточные агрегаты и примморфы представлены как альтернативные пути реагрегации (Valisano et al., 2006a) (Рисунок 14). В наших экспериментах клетки всех видов проходили эти стадии последовательно – сначала формировались первичные многоклеточные агрегаты, которые затем преобразовывались в примморфы. Такая же последовательность развития описана для многоклеточных агрегатов всех других видов губок (Ефремова, 1969, 1972; Короткова, 1972а; Волкова, Золотарева, 1981; Bagby, 1972;

Buscema et al., 1980; Custodio et al., 1998; Mller et al., 1999; Sipkema et al., 2003;

Chernogor et al., 2011a; Eerkes-Medrano et al., 2015; Ereskovsky et al., 2016).

В ходе наших экспериментов формирование примморфов у H. dujardinii происходило уже к 5-7 чпд, тогда как у L. complicata, H. panicea и H. aquaeductus – только к 4-8 спд. В схеме протекания процесса реагрегации Валисано и коллег быстрое формирование примморфов означает появление примморфов к 3 спд, а медленное – к 15 спд (Valisano et al., 2006a). В связи с этим, скорость формирования примморфов у H. dujardinii следует охарактеризовать как сверхбыструю и выделить в отдельный тип.

Сверхбыстрое формирование примморфов описано также для E. fluviatilis, S. lacustris, L. baicalensis, C. prolifera и Haliclona cf. permolis, у которых примморфы формируются к 12 чпд-2 спд (Ефремова, 1969; Wilson, 1907; Galtsoff, 1925b; Chernogor et al., 2011a;

Eerkes-Medrano et al., 2014; Ereskovsky et al., 2016). Возможно, к этому типу следует отнести и формирование примморфов у Neopetrosia problematica (de Laubenfels, 1930), Sycon coactum (Urban, 1906) и S. lingua, у которых этот процесс завершается к 2 спд (Короткова, 1972а; Eerkes-Medrano et al., 2014).

В ходе наших экспериментов мы наблюдали два пути формирования примморфов. Так, преобразование первичных многоклеточных агрегатов H. panicea и H. aquaeductus в примморфы сопровождалось выделением вокруг агрегатов оболочки из мертвых клеток и клеточного дебриса. В результате этого процесса происходили серьезные изменения клеточного состава агрегатов. Выделение клеточного дебриса из многоклеточных агрегатов в ходе формирования примморфов описано и для представителей рода Suberites (Mller et al., 1999; Sipkema et al., 2003). В тоже время у большинства исследованных на настоящий момент видов губок (в том числе, и у исследованных нами L. complicata и H. dujardinii) преобразование первичных многоклеточных агрегатов в примморфы не сопровождается серьезными изменениями клеточного состава агрегатов (Ефремова, 1969, 1972; Короткова, 1972а; Волкова, Золотарева, 1981; Bagby, 1972; Buscema et al., 1980; Custodio et al., 1998;

Mller et al., 1999; Sipkema et al., 2003; Chernogor et al., 2011a; Eerkes-Medrano et al., 2015;

Ereskovsky et al., 2016). В схеме протекания процесса реагрегации Валисано и коллег такие различия в формировании примморфов у разных видов губок не отражены (Valisano et al., 2006a) (Рисунок 14). Кроме того, в этой схеме отсутствует разделение стадий ранних примморфов и настоящих примморфов, что представляется нам важным.

У первичных многоклеточных агрегатов отсутствует какие-либо определенная структура, и в них еще не начались морфогенетические процессы, ведущие к прогрессивному развитию. Ранние примморфы могут быть рассмотрены как промежуточная, но существенная стадия между первичными многоклеточными агрегатами и настоящими примморфами. Настоящие примморфы, напротив, четко подразделены на внешнюю непрерывную экзопинакодерму и внутреннюю недифференцированную массу клеток. Ранние примморфы представляют собой стадию, на которой в поверхностной зоне агрегатов происходят наиболее активные морфогенетические процессы, ведущие к формированию экзопинакодермы. В наших экспериментах развитие агрегатов L. complicata и H. aquaeductus останавливалось до формирования сплошного слоя экзопинакодермы, на стадии ранних примморфов.

В схеме протекания процесса реагрегации Валисано и коллег примморфы представлены как завершающая стадия реагрегации (Valisano et al., 2006a) (Рисунок 14).

Однако в ходе наших экспериментов примморфы H. dujardinii были способны к прогрессивному развитию, которое заканчивалось формированием функциональной и жизнеспособной губки. Способность к прогрессивному развитию примморфов описана и для многих других видов губок (подробнее см. раздел 1.2.8). В связи с этим в общей схеме протекания процесса реагрегации в качестве завершающей стадии следует указать восстановление исходной организации губки. В процессе своего развития в функциональную губку примморфы проходят несколько важных этапов: 1) прикрепление к субстрату, 2) восстановление водоносной системы и скелета, 3) формирование оскулюма. При этом по тем или иным причинам развитие примморфов может остановится на любом из этих этапов, как это было показано в наших экспериментах с примморфами H. dujardinii. Поэтому данные промежуточные стадии развития примморфов также должны быть включены в общую схему протекания процесса реагрегации.

На основании анализа полученных нами, а также имеющихся в литературе данных мы предлагаем следующую общую схему протекания процесса реагрегации клеток губок (Рисунок 60):

Суспензия клеток – большинство клеток одиночные, могут присутствовать 1.

небольшие недиссоциированные группы клеток (чаще всего участки хоаноцитного эпителия). Клетки проявляют псевдоподиальную активность и в большинстве описанных случаев способны к амебоидному движению по субстрату.

Первичные многоклеточные агрегаты – представляют собой агрегаты клеток без 2.

какой-либо четко выраженной структуры. Морфогенетические процессы в них еще не начались.

Формирование примморфов (сверхбыстрое (менее 2 спд)\ быстрое (3-10 спд) \ 3.

медленное (более 10 спд); с изменением клеточного состава \ без изменения клеточного состава) – эта стадия характеризуется активными морфогенетическими процессами.

Наиболее вариабельная стадия процесса реагрегации.

Варьирует скорость формирования примморфов, а также характер морфогенетических процессов, которые в большинстве случаев связаны с образованием экзопинакодермы, но реже могут приводить к серьезным изменениям клеточного состава агрегатов:

а. Ранние примморфы – многоклеточные агрегаты, близкие к настоящим примморфам по многим признакам внутреннего строение, но лишенные сплошного слоя экзопинакодермы. На их поверхности идут активные морфогенетические процессы, связанные с формированием экзопинакодермы.

б. Настоящие примморфы – многоклеточные агрегаты, имеющие четкое подразделение на сплошной внешний слой экзопинакодермы и внутреннюю недифференцированную массу клеток. На этой стадии полностью завершаются морфогенетические процессы, связанные с формированием примморфов, но могут начинаться морфогенетические процессы, связанные с дальнейшим прогрессивным развитием и восстановление исходной организации губки.

Прогрессивное развитие примморфов – на этой стадии идут активные 4.

морфогенетические процессы во внутренних частях примморфов, ведущие к восстановлению анатомических структур губки (водоносной системы и скелета):

а. Прикрепление примморфов к субстрату – на этой стадии происходит установление постоянного контакта развивающегося примморфа с субстратом. В результате этого происходит формирование базопинакодермы, переход от радиальной к апико-базальной симметрии, а также изменения в распределении различных типов клеток внутри развивающегося примморфа. В основном, прикрепление к субстрату происходит сразу же после окончательного формирования настоящих примморфов, гораздо реже – после начала развития водоносной системы. По крайней мере, для ряда видов является необязательной стадией восстановления исходной организации.

б. Развитие водоносной системы и скелета – на этой стадии происходит постепенное формирование хоаноцитных камер и каналов водоносной системы, а также элементов органического и неорганического скелета. Морфогенетические процессы, лежащие в основе формирования этих структур, могут различаться у разных видов губок.

в. Формирование зачатков оскулюмов – завершающая стадия восстановления водоносной системы. Характеризуется появлением на поверхности развивающихся примморфов одного или нескольких зачатков будущих оскулюмов.

Функционирующая и жизнеспособная губка – финальная стадия процесса 5.

реагрегации. Восстановившаяся губка имеет небольшие размеры и по своей организации близка к рагону. На этой стадии заканчиваются морфогенетические процессы, связанные с реагрегацией клеток, и начинаются ростовые процессы, характерные для интактных губок.

В соответствии с приведенной схемой процесс реагрегации клеток у изученных нами видов может быть охарактеризован следующим образом:

1. L. complicata – быстрое формирование примморфов без изменения клеточного состава агрегатов, завершающая стадия реагрегации – ранние примморфы.

2. H. aquaeductus – быстрое формирование примморфов с изменением клеточного состава агрегатов, завершающая стадия реагрегации – ранние примморфы.

3. H. panicea – быстрое формирование примморфов с изменением клеточного состава агрегатов, завершающая стадия реагрегации – настоящие примморфы.

4. H. dujardinii – сверхбыстрое формирование примморфов без изменения клеточного состава агрегатов, примморфы способны к прогрессивному развитию, завершающая стадия реагрегации – функционирующая и жизнеспособная губка.

Приведенная схема протекания процесса реагрегации клеток позволяет детально описать характер этого процесса у всех изученных к настоящему моменту видов губок.

Кроме того, схема включает в себя ряд типов протекания реагрегации клеток, которые пока не описаны экспериментально (например, медленное формирование примморфов в сочетании со способностью примморфов к прогрессивному развитию).

Применение данной схемы позволит провести классификацию изученных видов губок на основании особенностей протекания реагрегации их клеток и, возможно, выявить связи между характером протекания реагрегации клеток и особенностями биологии или строения того или иного вида губок. Попытки выявления подобных связей уже делались, однако они касались лишь отдельных видов губок (Valisano et al., 2006a).

Выявление этих связей позволит в будущем применять приведенную схема протекания процесса реагрегации клеток для оценки характера этого процесса даже у неизученных видов, что сделает возможным проводить детальное планирование экспериментов и выбирать подходящие объекты исследования в зависимости от целей конкретного исследования.

4.2.2. Динамика процесса реагрегации клеток: внутривидовая вариабельность

Помимо межвидовых отличий в характере протекании реагрегации клеток губок существуют и внутривидовая вариабельность этого процесса. Так, ряд исследований реагрегации клеток H. panicea показал, что этот процесс не всегда идет одинаково (Языков, 1965а; Короткова, 1972а; Sipkema et al., 2003; Eerkes-Medrano et al., 2015). В экспериментах Иркес-Медрано и коллег (Eerkes-Medrano et al., 2015) клетки H. panicea были способны формировать лишь первичные многоклеточные агрегаты, которые никогда не трансформировались в примморфы. Языков (1965а), а также Сикема и коллеги (Sipkema et al., 2003) описали формирование примморфов клетками этого вида в течении 4-7 спд, что сходно с полученными нами результатами. В тоже время Короткова (1972а) описала восстановление функционирующих и жизнеспособных губок в ходе реагрегации клеток H. panicea.

Сходная внутривидовая вариабельность протекания реагрегации клеток характерна и для L. complicata, у которой Короткова (1972а) описала восстановление функционирующих и жизнеспособных губок, в то время как в наших экспериментах клетки данного вида были способны формировать лишь ранние примморфы.

Реагрегация клеток H. dujardinii также не всегда идет одинаково, однако в этом случае варьирует не финальная стадии реагрегации, а скорость протекания процесса. По данным Волковой и Золотаревой (1981) восстановление функционирующих и жизнеспособных губок в ходе процесса реагрегации у этого вида занимает 20-25 спд.

Тем не менее, наших экспериментах восстановление губок в культурах H. dujardinii происходило к 10-13 спд.

Одной из причин внутривидовой вариабельности протекания процесса реагрегации клеток могут быть различия в физиологическом состоянии губок, использованных в экспериментах. Физиологическое состояние губок, а также структура их соматических тканей очень сильно зависят от стадии жизненного и репродуктивного циклов, а также меняется в разные сезоны года (Иванова, 1978, 1981; Korotkova, 1979;

Ereskovsky, 2000; Valisano et al., 2006b). Влияние стадии репродуктивного цикла на способность клеток губок к реагрегации продемонстрирована на культурах клеток E. fluviatilis (Ефремова, 1969, 1972) и H. dujardinii (Волкова, Золотарева, 1981) (подробнее см. разделы 1.2.7 и 1.2.8). Однако, ни в одном из этих случаев не проводился детальный анализ динамики процесса реагрегации клеток в культурах, полученных от особей на разных стадиях репродуктивного цикла.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |
Похожие работы:

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Кемеровский государственный университет Биологический факультет Рабочая программа дисциплины Иммунология Направление подготовки 06.03.01 Биология Направленность (профиль) подготовки Физиология Уровень бакалавриата Форма обучения Очная Кемерово 2016 Содержание 1. Перечень...»

«www.ctege.info Задания С1 по биологии 1. Какую информацию может извлечь цитогенетик из хромосомного набора организма животного при его микроскопическом исследовании? Содержание верного ответа и указания к...»

«Концепция крупномасштабного развития инновационных систем производства и распределения метано-водородного топлива как эффективного альтернативного энергоносителя Олег...»

«Муниципальное бюджетное образовательное учреждение дополнительного образования станция юных натуралистов г. Холмска муниципального образования "Холмский городской округ" Сахалинской области Рассмотрена УТВЕРЖДЕНА на педагогическом совете директор МБОУДО СЮН г. Холмска протокол № от ""_201 г. С.В. Червякова Дополнительная общеобраз...»

«В.Д.Есаков. Новое о сессии ВАСХНИЛ 1948 года http://www.ihst.ru/projects/sohist/papers/esak94os.htm В. Д. Есаков НОВОЕ О СЕССИИ ВАСХНИЛ 1948 ГОДА © В.Д.Есаков Внешне может показаться, что положение в отечественной биол...»

«Экосистемы, их оптимизация и охрана. 2012. Вып. 7. С. 98–113. Биоценология и биология видов УДК 574.5/.6:612.176 ОТКЛИК ГИДРОБИОНТОВ НА СТРЕССОВЫЕ ФАКТОРЫ МОРСКИХ ЭКОCИСТЕМ Шахматова О. А. Институт биологии южных морей им. А. О. Ковалевского НАН Ук...»

«Труды Никитского ботанического сада. 2008. Том 130 83 ИНТРОДУКЦИЯ И СЕЛЕКЦИЯ НЕТРАДИЦИОННЫХ ПЛОДОВЫХ РАСТЕНИЙ В УКРАИНЕ С.В. КЛИМЕНКО, доктор биологических наук Национальный ботанический сад им. Н.Н. Гришко НАН Украины, г. Киев Введение Промышленное садоводство Украины представлено ограниченным числом видов плодовых растений: ябло...»

«ПРОГРАММА ВСТУПИТЕЛЬНОГО ИСПЫТАНИЯ по образовательной программе высшего образования – программе подготовки научно-педагогических кадров в аспирантуре ФГБОУ ВО "Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева" Направление 06.06.01 Биологические...»

«ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова кафедра биологии и общей генетики Дисциплина по выбору "Медико-биологические основы экологии"   Презентация по модулю № 5 Круговороты веществ доцент кафедры биологии и общей генетики к.м.н. Филиппова А.В. Содержание.   1. Биогеохимические круговороты.2. К...»

«Экология 4. Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений / под ред. В.А. Абакумова. – Л.: Гидрометеоиздат, 1983. – 239 с.5. Влияние горных разработок на лососевые реки Урала / Г.П. Сидоров, А.А. Братцев, А.Б. Захаров [и др.]. – Сыктывкар, 1989. – 14 с.6. Шубина, В.Н. Бентос лососевых рек Урала...»

«ДЕПАРТАМЕНТ ОБРАЗОВАНИЯ ГОРОДА МОСКВЫ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ВОРОБЬЁВЫ ГОРЫ" ЦЕНТР ЭКОЛОГИЧЕСКОГО И АСТРОНОМИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ ЦЭиАО Посвящается 90-летию Джеральда М. Даррелла XXXIX-...»

«МУНИЦИПАЛЬНОЕ АВТОНОМНОЕ ДОШКОЛЬНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ГОРОДА НИЖНЕВАРТОВСКА ДЕТСКИЙ САД №32 "БРУСНИЧКА" ПРОЕКТ – "ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ", КАК МЕТОД РАЗВИТИЯ ПОЗНАВАТЕЛЬНО-РЕЧЕВОЙ АКТИВНОСТИ ДЕТЕЙ ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА. Воспитатель: Кириллова Лариса Павловна Содержание Информационная карта перед...»

«АЗА ЛТТЫ АГРАРЛЫ УНИВЕРСИТЕТІ КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ІЗДЕНІСТЕР, №4 ИССЛЕДОВАНИЯ, Н ТИЖЕЛЕР РЕЗУЛЬТАТЫ ТО САН САЙЫН НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ, ШЫ АРЫЛАТЫН ВЫПУСКАЕМЫЙ ЫЛЫМИ ЖУРНАЛ ЕЖЕКВАРТАЛЬНО 1999 ж. ШЫ А ИЗДАЕТСЯ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Кемеровский государственный университет Биологический факультет Рабочая программа дисциплины Молекулярная биология клетки Направление подготовки 06.03.01 Биология Направлен...»

«Бушмелева К.И., Увайсов С.У., Плюснин И.И., Бушмелев П.Е. КЛАССИФИКАЦИЯ АЭРОКОСМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИРОВАНИЯ МАГИСТРАЛЬНЫХ ГАЗОПРОВОДОВ В работе предлагается новая классификация аэрокосмических методов диагностирования магистральных газопроводов с позиции анализа собственного и отраженного электромагнитного излучения о...»

«Т. И. Свистунова СТРУКТУРА МЕНТАЛЬНОГО ЛЕКСИКОНА ПРИ НАРУШЕНИЯХ ЯЗЫКОВОЙ СИСТЕМЫ: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЛАГОЛЬНОЙ СЛОВОИЗМЕНИТЕЛЬНОЙ МОРФОЛОГИИ 1 Работа представлена кафедрой...»

«Японские исследования. 2016. №1 www.ifes-ras.ru/js Экологические проблемы в Японии: между прошлым и будущим И.С. Тихоцкая После краткого исторического экскурса в статье анализируются особенности...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОУ ВПО "УРАЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЛЕСОТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Кафедра физической, органической химии и нанодисперсных технологий В.Т. Брунов В.В. Свиридов ВОПРОСЫ И ЗАДАЧИ ПО ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ (ЧАСТЬ 1) Методические указания для самостоятельной работы студентов по физической х...»

«Пояснительная записка В соответствии с концепцией модернизации Российского образования элективные курсы являются обязательным компонентом школьного обучения элективный курс "Общие закономерности общей биологии" предназначен для учащихся 10 11 классов. Курс позволяет не только расширить и системат...»

«ИНВЕНТАРИЗАЦИЯ ПРЕДПРИЯТИЯ: БУХГАЛТЕРСКИЙ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТ © Васильев А.К. Волгоградская государственная сельскохозяйственная академия, г. Волгоград Бухгалтерская инвентаризация имущ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Кемеровский государственный университет Биологический факультет Рабочая программа дисциплины ИСТОРИЧЕСКАЯ ГЕОЛОГИЯ Направление подготовки 05.03.01 Геол...»

«Общероссийская общественная организация "Федерация анестезиологов и реаниматологов" (ФАР) Российская ассоциация специалистов по хирургическим инфекциям (РАСХИ) Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ) Диагностика и лечение микозов в отделениях реанимаци...»

«МЕСТООБИТАНИЕ ACONITUM SEPTENTRIONALE KOELLE НА ТЕРРИТОРИИ САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ А.В. Иванова Институт экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти svsaxonoff@yandex.ru Борец северный (Aconitum septen...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" Балтина Т.В. Методические материалы для самостоятельной работы...»

«Вестник МГТУ, том 16, №2, 2013 г. стр.233-241 УДК 338 : 504 Эколого-экономический анализ региональной политики в сфере обращения с отходами (на примере Мурманской области) Е.М. Ключникова2, В.А. Маслобоев1,2 Апатитский филиал МГ...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.