WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«Способность губок классов Demospongiae и Calcarea к развитию из диссоциированных клеток ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук ...»

-- [ Страница 1 ] --

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи

Лавров Андрей Игоревич

Способность губок классов Demospongiae и Calcarea

к развитию из диссоциированных клеток

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.02.04 – зоология

Научный руководитель

к.б.н., доцент Косевич И.А.

Москва, 2016

Оглавление

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика типа Губки (Porifera)

1.2. Реагрегация клеток губок

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Объекты исследования

2.2. Диссоциации тканей

2.3. Культивирование суспензий клеток

2.4. Оценка влияния характера субстрата и переноса культур в аквариум с естественной морской водой на реагрегацию клеток и последующее развитие примморфов

2.5. Фиксация многоклеточных агрегатов

2.6. Гистологическое исследование многоклеточных агрегатов

2.7. Ультраструктурное исследование многоклеточных агрегатов

2.8. Иммуногистохимическое исследование многоклеточных агрегатов

2.9. Измерения

Глава 3. Результаты

3.1. Влияние метода диссоциации тканей на процесс реагрегации клеток.................. 66

3.2. Поведение клеток в суспензии и начальные этапы реагрегации

3.3. Динамика реагрегации клеток

3.4. Влияние характера субстрата на прикрепление и последующее развитие примморфов

3.5. Влияние переноса многоклеточных агрегатов в аквариум с естественной морской водой на их дальнейшее развитие

3.6. Строение многоклеточных агрегатов и примморфов

Глава 4. Обсуждение

4.1. Диссоциация тканей, поведение клеток в суспензии и начальные этапы реагрегации

4.2. Динамика реагрегации клеток

4.3. Строение и морфогенетические потенции многоклеточных агрегатов.............. 116 Глава 5. Заключение

Выводы

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Приложение 1. Таблицы

Приложение 2. Рисунки

–  –  –

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. Проблема происхождения и ранней эволюции многоклеточных животных является одной из важнейших в современной биологии. Для решения этой проблемы необходимо иметь представление о том, как был устроен последний общий предок Metazoa. Это касается реконструкции не только анатомического строения этого животного, но и его экологии, физиологии, а также механизмов функционирования клеток и тканей.

Многоклеточность не могла возникнуть без появления механизмов координации клеточных делений, дифференцировок и программируемой гибели, а также межклеточной адгезии и узнавания. Эволюция этих механизмов обеспечивала все более устойчивую интеграцию отдельных клеток в единые соподчиненные структуры, что в конечном итоге привело к переходу от одноклеточных организмов, через одноклеточные колониальные формы, к настоящим многоклеточным организмам (Захваткин, 1949; Haeckel, 1874; Btschli, 1884; Metschnikoff, 1886; Nielsen, 2008, 2012;

Mikhailov et al., 2009). К настоящему моменту получено множество данных о поведении клеток, молекулярных механизмах их интеграции и коммуникации в составе интактных тканей, во время эмбрионального развития, а также в ходе восстановительных морфогенезов у большого числа беспозвоночных и позвоночных животных. Результаты исследований позволили выявить общие закономерности функционирования тканей многоклеточных животных и высказать предположения относительно процессов, происходивших на ранних этапах становления многоклеточности (Tyler, 2003; Srivastava et al, 2010; Adamska et al, 2011). Тем не менее, в данной области остается множество нерешенных проблем. Для дальнейшего прогресса в решении вопроса о возникновения многоклеточности представляется перспективным подробное изучение механизмов интеграции и коммуникации клеток в составе тканей низших многоклеточных животных, в частности у представителей типа Porifera.

Губки (тип Porifera) являются наиболее древней группой ныне живущих многоклеточных животных. Во взрослом состоянии у них отсутствуют какие-либо органы, пищеварительная, нервная и мышечная системы. Единственной обособленной структурой в теле губок является водоносная система, посредством которой животное прокачивает через свое тело огромные объемы воды для получения питания и кислорода (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012). Несмотря на такую простую организацию тела, многие механизмы, обеспечивающие функционирование тканей, коммуникацию и интеграцию клеток, а также протекание морфогенезов у губок сходны с таковыми у высших многоклеточных животных (Larroux et al., 2006; Nichols et al., 2006; Srivastava et al., 2010; Ereskovsky et al., 2013; zbek et al., 2010; Riesgo et al., 2014).

В организации губок присутствуют черты, абсолютно нехарактерные для других многоклеточных животных. Уникальной чертой организации губок можно считать мобильность и пластичность их анатомических и клеточных структур. Поддержание высокой эффективности фильтрации в меняющихся гидродинамических условиях окружающей среды является крайне важным для губок, поэтому водоносная система этих животных подвергается постоянной перестройке и меняет свою конфигурацию, чтобы наилучшим образом соответствовать текущим гидродинамическим условиям. В основе высокой пластичности водоносной системы губок лежит пластичность дифференцировок клеток и их высокая мобильность. В теле губок абсолютно все клетки находятся в состоянии постоянного перемещения и большинство из них способно к трансдифференцировкам (Harris, 1987; Bond, 1992; Ereskovsky, 2010).

Одной из форм описанной пластичности организации является способность клеток губок к реагрегации после диссоциации тканей животного. В ходе этого процесса происходит формирование многоклеточных агрегатов разнообразного строения, и при определенных условиях может происходить полное восстановление исходной организации животного (Короткова, 1972а; Wilson, 1907; Huxley, 1912; Galtsoff, 1925b).

Эти процессы являются не простой “самосборкой” и сортировкой дифференцированных клеток. В ходе реагрегации клеток и последующего восстановления губки имеют место активные клеточные миграции, дедифференцировки и трансдифференцировки определенных клеточных типов, а судьба клеток, судя по всему, определяется их положением в многоклеточном агрегате (Ефремова, 1969, 1972; Короткова, 1972а;

Никитин, 1973б; Волкова, Золотарева, 1981).

Эти факты делают процесс реагрегации клеток удобной модельной системой, которая позволяет в контролируемых лабораторных условиях изучать многие детали функционирования тканей губок:

поведение и взаимодействие различных клеточных типов друг с другом и с внеклеточным матриксом, способности клеток к дедифференцировкам и трансдифференцировкам, пути восстановления исходных связей между клетками и формирования основных структурных элементов организма. Кроме того, многоклеточные агрегаты губок являются удобной модельной системой для изучения некоторых аспектов физиологии и молекулярной биологии губок (Черногор и др., 2014;

Custodio et al., 1998; Krasko et al., 2002; Le Pennec et al., 2003; Zhang et al., 2003a; Mller et al., 2004b; Cao et al., 2007a, 2007b; Valisano et al., 2007a; Chernogor et al., 2011b).

Практический интерес представляют долговременные культуры многоклеточных агрегатов, формирующихся в ходе реагрегации, которые могут стать основой для получения биологически активных веществ губок для фармацевтической и косметической промышленности (Mller et al., 2000; Fernndez-Busquets et al., 2002;

Pomponi, 2006).

C момента первого описания реагрегации клеток губок Уилсоном в 1907 году (Wilson, 1907) этот процесс стал объектом многих исследований. Изучались различные аспекты реагрегации клеток: молекулярные основы процесса (Spiegel, 1955; Humphreys, 1963, 1970; Mller, Mller, 1980; Fernndez-Busquets, 2008), поведение клеток в суспензии и на ранних этапах реагрегации (Ефремова, Дроздов, 1970; Никитин, 1973а;

Galtsoff, 1923, 1925a; Noble, Peterson, 1972; Gaino et al., 1985; Gaino, Magnino, 1999), способность клеток к распознаванию “свое-чужое” (Wilson, 1910; Galtsoff, 1923, 1925a;

Curtis, 1962; Spiegel, 1954; Humphreys, 1963, 1970; Van de Vyver, 1975; Leith, 1979;

Custodio et al., 2004), особенности физиологии многоклеточных агрегатов (Черногор и др., 2014; Custodio et al., 1998; Krasko et al., 2002; Le Pennec et al., 2003; Zhang et al., 2003a;

Mller et al., 2004b; Cao et al., 2007a, 2007b; Valisano et al., 2007a; Chernogor et al., 2011b), способность различных клеток к дедифференцировкам и трансдифференцировкам (Ефремова, 1968; Короткова, Соколова, 1973; Никитин, 1973б; Волкова, Золотарева, Buscema et al., 1980), а также возможности получения 1981; Bagby, 1972;

долговременных культур многоклеточных агрегатов для биотехнологических целей (Mller et al., 2000, 2004a; Sipkema, 2004). Тем не менее, многие аспекты реагрегации клеток губок до сих пор остаются неясными. В частности, к таким аспектам относятся вопросы, касающиеся поведения и судьбы различных типов клеток в ходе восстановления интактной губки из многоклеточных агрегатов, а также условий и механизмов, которые обеспечивают возможность восстановления исходной организации животного после диссоциации тканей. Кроме того, часть полученных ранее данных требуют проверки и расширения с использованием современных ультраструктурных и иммуногистохимических методов.

Настоящая работа посвящена изучению процесса реагрегации клеток у четырех видов морских губок:

Halichondria panicea (Pallas, 1766) (кл. Demospongiae, отр. Suberitida);

1) Haliclona aquaeductus (Schmidt, 1862) (кл. Demospongiae, отр. Haplosclerida);

2) Halisarca dujardinii Johnston, 1842 (кл. Demospongiae, отр. Chondrillida);

3) Leucosolenia complicata (Montagu, 1814) (кл. Calcarea, отр. Leucosolenida).

4) Данные виды являются типичными и широко распространенными представителями морских бентосных сообществ. Они выбраны в качестве объектов исследования благодаря особенностям своей экологии и систематического положения.

Все исследованные виды способны переносить значительные колебания условий окружающей среды (температуры, солености и т.д.), и поэтому подходят для проведения экспериментальных лабораторных исследований. Исследованные виды класса Demospongiae являются представителями трех из четырех крупных клад, которые в настоящее время выделяются методами молекулярной филогении в составе этого класса: H. dujardinii – клада Myxospongiae, H. panicea – клада Heteroscleromorpha и H. aquaeductus – клада Haploscleromorpha (Hill et al., 2013; Redmond et al., 2013).

Leucosolenia complicata является представителем крупного подкласса Calcaronea, включающего в себя основную часть видов класса Calcarea (Van Soest et al., 2015).

Цель данной работы – провести анализ закономерностей и особенностей протекания процесса реагрегации клеток и восстановления исходной организации губки у представителей классов Demospongiae и Calcarea.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

подобрать оптимальный метод диссоциации тканей губок и условия 1) культивирования клеток и многоклеточных агрегатов;

описать динамику протекания процесса реагрегации клеток у исследуемых видов, 2) в том числе при различных физиологических состояниях тканей, связанных с репродуктивным циклом данных видов;

детально описать строение ключевых стадий реагрегации клеток и 3) восстановления исходной организации губки на гистологическом и ультраструктурном уровнях;

проследить поведение и судьбу различных типов клеток в ходе реагрегации 4) клеток и восстановления исходной организации губок.

Научная новизна работы. В ходе работы проведены исследования динамики реагрегации клеток, а также строения многоклеточных агрегатов у четырех видов морских губок. В результате работы удалось подобрать оптимальный метод диссоциации тканей губок и оптимальные условия дальнейшего культивирования суспензий клеток. Впервые была описана реагрегации клеток H. aquaeductus. Впервые проведено сравнительное исследование динамики процесса реагрегации клеток H. panicea и H. dujardinii в различные периоды репродуктивного цикла данных видов, и предложено объяснение наблюдаемой внутривидовой вариабельности протекания процесса реагрегации клеток у губок. На основании собственных и литературных данных составлена общая схема протекания реагрегации клеток губок, в полной мере отражающая наиболее важные этапы этого процесса.

В ходе работы были подобраны методы фиксации и последующей пробоподготовки многоклеточных агрегатов губок для иммуногистохимических и ультраструктурных исследований. На основании иммуногистохимических и ультраструктурных исследований первичных многоклеточных агрегатов, примморфов и развивающихся примморфов впервые проведено детальное описание морфогенезов, происходящих при развитии агрегатов, и прослежена судьба некоторых типов клеток в ходе процесса реагрегации.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основании собственных данных, а также анализа литературных данных была предложена общая схема реагрегации клеток губок, включающая в себя несколько ранее не описанных вариантов реагрегации. Предложенная схема позволяет проводить детальное сравнительное описание и классификацию процесса реагрегации клеток у любого изученного на данный момент вида губок. Применение данной схемы к широкому спектру видов губок позволяет выявить связи между характером протекания реагрегации клеток и особенностями биологии или строения того или иного вида.

Показано, что основная роль в процессе реагрегации клеток и восстановления исходной организации животного у всех изученных на данный момент видов губок принадлежит активной локомоции клеток, а также дедифференцировке и трансдифференцировке определенных типов клеток. Результаты настоящей работы показывают, что на протекание процесса реагрегации клеток конкретного вида губок влияет ряд фактором как внутренних (физиологическое состояние особей, используемых в экспериментах), так и внешних (условия постановки экспериментов).

Таким образом показано, что для выявления полного морфогенетического потенциала клеток и многоклеточных агрегатов конкретного вида необходимо сравнительное изучение процесса реагрегации его клеток на разных стадиях жизненного и репродуктивного циклов, а также в разные сезоны года.

Полученные в работе результаты позволяют использовать представителей типа Губки как модельные объекты для дальнейшего сравнительного исследования механизмов функционирования тканей и межклеточного сигналлинга у многоклеточных животных.

Результаты работы использованы в курсах “Введение в специальность”, “Сравнительная эмбриология беспозвоночных” и “Зоология беспозвоночных”, читаемых на кафедре зоологии беспозвоночных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Положения, выносимые на защиту:

Основную роль в процессе реагрегации играет способность клеток губок к 1) движению и изменению формы. За счет формирования и сокращения псевдоподий происходит первичная агрегация клеток. В дальнейшем за счет локомоции клеток и изменений их формы в многоклеточных агрегатах формируются основные анатомические структуры губки. Ограничение подвижности и возможности изменения формы клеток в составе многоклеточных агрегатов приводит к остановке их прогрессивного развития.

Развитие многоклеточных агрегатов связано с дедифференцировками и 2) трансдифференцировками клеток в их составе. Дедифференцировки клеток происходят на начальных этапах реагрегации и приводят к унификации морфологии и ультраструктуры большей части клеток агрегатов. Трансдифференцировки клеток начинаются с формирования экзопинакодермы у примморфов, и активно участвуют в формировании элементов водоносной системы и клеток мезохила в ходе прогрессивного развития примморфов.

Реагрегации клеток проходит сходным образом у всех изученных к настоящему 3) времени видов губок. Вместе с тем, существует четкая межвидовая и внутривидовая вариабельность в протекании реагрегации, которая выражаются в различиях в скорости протекания процесса, в особенностях трансформации первичных многоклеточных агрегатов в примморфы, а также в завершающей стадии процесса. Значительное влияние на процесс реагрегации оказывает исходное физиологическое состояние тканей губок.

Достоверность результатов, полученных в диссертационной работе, обеспечивается корректным использованием современных методов исследований. При экспериментальной работе живые губки и суспензии их клеток содержали в оптимальных условиях, и с суспензиями клеток было проведено достаточное количество повторных экспериментов. При фиксации и подготовке образцов многоклеточных агрегатов для гистологических, иммуногистохимических и ультраструктурных исследований были использованы корректные протоколы, отобранные на основании предварительных исследований. При проведении гистологических, иммуногистохимических и ультраструктурным исследований была исследована достаточная выборка, а также была использована система негативных и позитивных контролей. Фотоизображения, полученные в ходе исследований, подвергались лишь незначительной корректировке яркости и контрастности, затрагивающей все пикселы изображений.

Апробация работы.

Основные результаты данной работы были доложены и обсуждены на следующих конференциях:

Научная конференция «Морская биология, геология, океанология – 1) междисциплинарные исследования на морских стационарах», посвященная 75-летию Беломорской биологической станции МГУ (Москва, Россия, 27 февраля – 1 марта 2013 г.);

XX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых 2) "Ломоносов-2013" (Москва, Россия, 8-13 апреля 2013 г.);

XII Международная конференция с элементами школы для молодых ученых и 3) аспирантов “Проблемы изучения, рационального использования и охраны природных ресурсов Белого моря” (Петрозаводск, Россия, 30 сентября – 4 октября 2013 г.);

Всероссийская конференция с международным участием “К 135-летию со дня 4) рождения П.П. Иванова” (Санкт-Петербург, Россия, 22-24 октября 2013 г.);

II Международная молодежная научно-практическая конференция “Морские 5) исследования и образование” (Москва, Россия, 28-30 октября 2013 г.);

3nd International congress on invertebrate zoology (Берлин, Германия, 3-7 августа 6) 2014 г.);

XXII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых 7) ученых "Ломоносов-2015" (Москва, Россия, 13-17 апреля 2015 г.);

International workshop “The origin of metazoan” (Йер, Франция, 14-16 октября 8) 2015 г.).

Также результаты работы были неоднократно доложены и обсуждены на рабочих семинарах "Низшие многоклеточные: биология, морфогенез, эволюция" кафедры зоологии беспозвоночных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

По результатам работы опубликовано 11 печатных работ, из них 3 статьи – в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 8 статьей – в материалах международных и всероссийских конференций.

Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю – к.б.н. Косевичу Игорю Арнольдовичу – за всестороннюю поддержку и помощь на протяжении всей работы, за множество ценных советов и обсуждений, за его терпение и понимание.

Автор благодарит всех сотрудников Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова МГУ, в особенности директора станции д.б.н., проф. А.Б. Цетлина и водолазную команду, за предоставление возможности проведения экспериментов с живым материалом и помощь в сборе материала. Автор искренне признателен сотрудникам Межкафедральной лаборатории электронной микроскопии Биологического факультета МГУ, в особенности А.Г. Богданову, и сотрудникам Ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ, в особенности П.А. Зыкину и М.Г. Воробьеву, за предоставление возможности исследовать материал с помощью трансмиссионных и сканирующих электронных микроскопов. Автор благодарит к.б.н. А.Э. Вишнякова за ценнейшие советы, рекомендации и помощь в осуществлении настоящего исследования.

Автор искренне благодарит всех сотрудников и заведующего кафедры зоологии беспозвоночных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова член-корр.

РАН, д.б.н. В.В. Малахова за поддержку и ценные советы.

–  –  –

Губки (тип Porifera) – это исключительно водные прикрепленные многоклеточные животные-фильтраторы, имеющие очень простую организацию. Губок можно встретить во всех водных биотопах планеты – от морских мелководий до ультраабиссали, а также в пресных водоемах всех континентов, за исключением Антарктиды.

В настоящее время тип Porifera включает примерно 8500 валидных видов, которые образуют четыре класса:

Demospongiae, Calcarea, Hexactinellida и Homoscleromorpha (Van Soest et al., 2015). По некоторым оценкам, неописанными остаются еще 18000 видов губок (Appeltans et al., 2012).

1.1.1. Анатомическое и гистологическое строение губок

Во взрослом состоянии губки имеют крайне примитивную организацию – у них отсутствуют какие-либо органы, пищеварительная, нервная и мышечная системы.

Представители классов Demospongiae, Calcarea и Homoscleromorpha во взрослом состоянии имеют клеточное строение, а представители класса Hexactinellida – синцитиальное (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012).

Приведенные ниже данные будут касаться только губок с клеточным строением.

Тело губок можно разделить на три части: внешние эпителии, внутренние эпителии и мезохил. Внешние эпителии представлены экзопинакодермой и базопинакодермой (Рисунок 1). Экзопинакодерма покрывает большую часть наружной поверхности губки. Это однослойный эпителий, состоящий из веретеновидных или Тобразных клеток, экзопинакоцитов (Рисунок 2). Базопинакодерма покрывает лишь поверхность губки, обращенную к субстрату. Это также однослойный эпителий, во многих чертах напоминающий экзопинакодерму. Однако базопинакоциты имеют сильно развитый синтетический аппарат и способны к активному синтезу вещества, обеспечивающего прикрепление губки к субстрату (Bergquist, 1978; Simpson, 1984;

Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012).

Внутренние эпителии представлены эндопинакодермой и хоанодермой, которые выстилают отделы водоносной системы. Водоносная система – это наиболее характерная черта организации губок. Она представляет собой сеть каналов и камер, пронизывающих все тело животного. Каналы водоносной системы выстланы одним слоем уплощенных эндопинакоцитов (Рисунок 2А, Б), а камеры – хоаноцитами, которые несут жгутик, окруженный воротничком микроворсинок (Рисунок 3). Вода из окружающей среды попадает в водоносную систему через множество мелких отверстий в экзопинакодерме губки – остий, и выбрасывается через одно или несколько крупных отверстий – оскулюмов (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012) (Рисунок 1).

Посредством водоносной системы губка прокачивает через свое тело огромные объемы воды, из которой получает необходимые для жизни питание и кислород. За счет постоянного биения жгутиков хоаноциты создают направленный ток воды, проходящий через тело животного. Хоаноциты также обеспечивают питание губки – большая часть пищевых частиц захватывается из воды именно этими клетками (Bergquist, 1978;

Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012).

Весь объем тела между каналами, камерами водоносной системы и внешней поверхностью губки занимает мезохил. В мезохиле губок находится большое количество подвижных клеток разных типов, развитый внеклеточный матрикс, состоящий в основном из коллагена и галектина (Ereskovsky, 2010), элементы скелета животного, а также разнообразные симбиотические микроорганизмы (Рисунок 1). Хотя клетки мезохила выполняют множество разных функции, их можно разделить на две группы: клетки, выполняющие опорно-соединительные функции, и клетки, выполняющие защитно-секреторные функции Клетки, (Ereskovsky, 2010).

выполняющие опорно-соединительные функции, участвуют в синтезе внеклеточного матрикса и скелетных элементов губок: 1) лофоциты и колленциты, синтезирующие коллаген (Рисунок 4А), 2) спонгоциты, синтезирующие спонгин (Рисунок 4Б), и 3) склероциты, синтезирующие неорганические элементы скелета (Рисунок 4В) (подробнее см. ниже). Также к этой группе клеток относятся сократимые клетки, миоциты, обнаруженные у ряда видов губок (Bergquist, 1978).

Клетки, выполняющие защитно-секреторные функции, обеспечивают защиту внутренней среды организма (в первую очередь посредствам фагоцитоза и бактерицидной активности), а также участвуют в запасании питательных веществ и распределении пищевых частиц и кислорода. К этой группе относятся амебоциты и разнообразные клетки с включениями (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010;

Leys, Hill, 2012) (Рисунок 5).

Помимо клеток в мезохиле губок находится скелет животного, который может состоять из органических и минеральных элементов. Минеральные элементы скелета представлены микроскопическими иглами разнообразного строения – спикулами (Рисунок 6А, Б). У представителей разных классов материалом для построения спикул может служить либо карбонат кальция (CaCO3) (Calcarea), либо оксид кремния (SiO2) (Demospongiae и Homoscleromorpha) (Bergquist, 1978; Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010;

Leys, Hill, 2012).

Органическая часть скелета губок построена из коллагена и спонгина. Коллаген всегда представлен в виде фибрилл, которые пронизывают весь мезохил, а также формируют сгущения под эпителиальными слоями. У большинства губок коллаген играет второстепенную роль в построение скелета, хотя у некоторых представителей Demospongiae (семейство Halisarciidae) скелет полностью построен из фибриллярного коллагена. Спонгин – это особая форма коллагена, которая встречается только у губок.

Это вещество играет важную роль в построение скелета многих видов губок. Чаще всего встречается периспикулярный спонгин, который соединяет спикулы друг с другом в местах их пересечения (Рисунок 6В). Спонгин также может использоваться для формирования скелетных структур довольно сложного строения (например, спонгиновые фибрилл различного строения и спонгиновые спикулы) (Bergquist, 1978;

Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012) (Рисунок 6Г, Д, Е).

Одной из важнейших особенностей биологии губок является их симбиоз с микроорганизмами. В своем теле губки несут обширное и разнообразное сообщество симбиотических микроорганизмов, многие из которых являются видоспецифичными.

При этом у некоторых видов губок симбионты могут составлять до 40% объема тела животного. Симбионтами губок могут быть бактерии, археи, а также одноклеточные эвкариоты (грибы и водоросли). По положению в теле выделяют внеклеточных, внутреклеточных и внутреядерных симбионтов (Taylor et al., 2007; Webster, Taylor, 2012).

Сегодня о конкретных механизмах взаимодействия губок и их симбионтов известно мало, однако уже сейчас ясно, что симбиотическое сообщество играет огромную роль в жизни губок и во многих случаях важно для выживания хозяина. Так, было показано, что симбиотические цианобактерии тропических губок передают хозяину продукты фотосинтеза и тем самым покрывают до 50% всех его энергетических затрат. Потеря этих симбионтов приводит к постепенному ухудшению состояния губок.

В ряде других ассоциаций симбионты участвуют в выработке биологически активных веществ, которые используются губками как средства химической защиты от хищников, обрастателей и патогенных микроорганизмов (Taylor et al., 2007; Webster, Blackall, 2009;

Webster, Taylor, 2012). Еще одним доводом в пользу важности симбионтов в жизни губок являются многочисленные примеры вертикальной передачи бактерий от материнской губки к личинкам (Ereskovsky, 2010).

Среди представителей губок существует четыре типа организации тела, которые в первую очередь характеризуют устройство водоносной системы (Bergquist, 1978;

Simpson, 1984; Ereskovsky, 2010; Leys, Hill, 2012) (Рисунок 7):

асконоидная – вся водоносная система представлена единой полостью 1.

(атриумом), выстланной хоанодермой. Хоанодерма прерывается только в местах выхода каналов, каждый их которых образован единственной клеткой, пороцитом. Пороциты обеспечивают связь внешней среды с атриумом. Степень развития мезохила губок с асконоидной организацией незначительна (Рисунок 7А);

сиконоидная – водоносная система состоит из хоаноцитных камер и атриума.

2.

Хоаноцитные камеры являются выпячиваниями стенки атриума и ориентированы перпендикулярно апико-базальной оси животного. Атриум выстлан эндопинакодермой.

Вода поступает в хоаноцитные камеры через каналы, образованные пороцитами.

Мезохил развит слабо (Рисунок 7Б);

силеибидная – этот тип организации сходен с сиконоидным, но характеризуется 3.

утолщенным мезохилом и появлением настоящих приводящих каналов, выстланных эндопинакодермой, по которым вода из окружающей среды поступает в хоаноцитные камеры (Рисунок 7В);

лейконоидная – мезохил достигает значительного развития. Водоносная система 4.

состоит из большого количества хоаноцитых камер, залегающих в толще мезохила.

Хоаноцитные камеры соединены с окружающей средой посредством большого количества приводящих и отводящих каналов, выстланных эндопинакодермой (Рисунок 7Г).

1.1.2. Филогенетическое положение губок

Положение губок в системе многоклеточных животных долгое время оставалось дискуссионным.

Существовало три точки зрения на данный вопрос: 1) губки являются самостоятельной эволюционной ветвью, возникшей независимо от Metazoa, 2) губки являются представителями отдельного подцарства Parazoa внутри многоклеточных животных, 3) губки и многоклеточные животные являются потомками одного предка и образуют единую эволюционную ветвь. При этом многие исследователи, придерживавшиеся первых двух точек зрения, часто характеризовали губок как животных, находящихся по своей организации между колониальными одноклеточными организмами и настоящими многоклеточными животными (Ересковский, 2005;

Bergquist, 1978). Причиной этому служили особенности строения тела губок и сходство хоаноцитов с протистами из группы Choanoflagellata (Adamska et al., 2011).

С развитием методов молекулярной биологии стало очевидным, что губки и настоящие многоклеточные животные (Eumetazoa) образуют единую монофилетическую кладу (Рисунок 8). Публикации последних лет на эту тему указывают не только на монофилию клады губок и Eumetazoa, но и на базальное положение губок в кладе многоклеточных животных (Srivastava et al., 2008, 2010;

Philippe et al., 2009; Sperling et al., 2009, 2010; Pick et al., 2010; Nosenko et al., 2013).

Древность губок подтверждается и палеонтологической летописью – наиболее древние находки спикул губок неопределенной систематической принадлежности датируются Криогеном (Reitner, Wrheide, 2002).

В последние годы обострились споры о том, является ли тип Porifera монофилетической или парафилетической группой (Рисунок 9).

В монофилетической модели филогении губок все классы имеют общего предка и формируют две клады:

Demospongiae+Hexactinellida и Calacrea+Homoscleromorpha (Phillipe et al., 2009; Pick et al., 2010). В парафилетической модели классы губок поочередно отделяются от общего ствола многоклеточных животных: сначала клада Demospongiae+Hexactinellida, затем Calcarea, и лишь затем Homoscleromorpha, которые оказываются близкородственны Eumetazoa (Borchiellini et al., 2008; Sperling et al., 2009, 2010). Для клады Homoscleromorpha+Eumetazoa было предложено название Epiteliozoa (Sperling et al., 2009). И хотя спор до сих пор не окончен, на сегодняшний день монофилетическая модель филогении губок получает большую поддержку (Nosenko et al., 2013; Riesgo et al., 2014).

1.1.3. Механизмы функционирования тканей губок

Монофилия губок и Eumetazoa позволяет предположить, что механизмы, обеспечивающие функционирование тканей, коммуникацию и интеграцию клеток, а также протекание морфогенезов у губок сходны с таковыми у высших многоклеточных животных. Одним из важнейших эволюционных приобретений многоклеточных считается появление эпителиальных тканей (Mller, 2006). Однако наличие настоящих эпителиев у губок остается спорным вопросом. В большинстве случаев под настоящим эпителиями понимаются ткани, построенные из поляризованных клеток, скрепленных заякоривающими и запирающими контактами, и под которыми находится базальная мембрана (Tyler 2003; Fahey, Degnan, 2010). Среди губок лишь представители класса Homoscleromorpha имеют явную базальную мембрану, в составе которой присутствует коллаген IV типа, и межклеточные контакты типа zonula adhaerens, и, по общему мнению, обладают настоящими эпителиями (Boute et al., 1996; Gazave et al., 2011). Тем не менее, гены, отвечающие у представителей Eumetazoa за формирование базальной мембраны (гены коллагена IV типа, нидогена и перлекана), а также гены, отвечающие за образование запирающих контактов (гены клаудина) были обнаружены в транскриптомах представителей всех классов губок (Riesgo et al., 2014). При ультраструктурных исследованиях представителей классов Demospongiae и Calcarea часто обнаруживались межклеточные контакты, которые трактовались авторами исследований как тот или иной тип заякоривающего или запирающего контакта. Однако межклеточные контакты губок всегда отличались по своему строению от типичных контактов в эпителиях Eumetazoa: заякоривающие контакты губок выглядят менее электронно-плотными, в строение запирающих контактов часто отсутствует четкий лестничный рисунок. Типичная базальная мембрана также отсутствует у представителей этих групп губок, и пинакодерма и хоанодерма подстилаются только мощным слоем фибриллярного коллагена. Именно из-за отсутствия типичных ультраструктурных особенностей пинакодерма и хоанодерма большинства губок часто не рассматриваются как настоящие эпителии (Tyler, 2003; Leys, 2007; Leys et al., 2009; Fahey, Degnan, 2010;

Leys, Riesgo, 2012).

Однако помимо строения эпителия не менее важна его основная физиологическая функция – барьерная. Эпителии позволили многоклеточным животным построить сложные тела, состоящие из отдельных компартментов, поток веществ между которыми полностью контролируется. Кроме того, эпителии дали возможность надежно обособить внутреннюю среду организма, создать и поддерживать в ней необходимые для функционирования клеток условия (Nichols et at., 2006). Барьерные свойства эпителия подтверждаются путем измерения трансэпителиального сопротивления и проверкой способности эпителия задерживать молекулы-трейсеры (в качестве трейсеров обычно используют разнообразные дексдраны весом 10 кДа или рутениевый красный весом 0,85 кДа). Барьерные свойства конкретного эпителия зависит от его специализации, но во всех случаях эпителии Eumetazoa генерируют трансмембранное сопротивление 10 см2 и способны задерживать молекулы весом 10 кДа (Leys, Riesgo, 2012). Исследования барьерной функции пинакодермы и хоанодермы на пресноводной губке Spongilla lacustris (Linnaeus, 1759) (класс Demospongiae) показали, что эти ткани способны генерировать сопротивление 500-1500 см2 и полностью задерживать молекулы рутениевого красного (Adams et al., 2010). Таким образом, пинакодерма и хоанодерма этого вида губок по своей барьерной функции не уступает настоящим эпителиям Eumetazoa.

Представители всех групп губок имеют крайне похожую ультраструктуру пограничных тканей и набор генов, предположительно участвующих в образовании межклеточных контактов (Leys, Riesgo, 2012; Riesgo et al., 2014). Учитывая это, можно предположить, что пинакодерма и хоанодерма всех представителей типа Porifera в полной мере способны выполнять барьерную функцию, и в этом смысле полностью соответствуют настоящим эпителиям высших многоклеточных животных. В свете этого упомянутые выше различия в строении эпителиев губок и Eumetazoa вторичны и не должны служить основным критерием в определении статуса пограничных тканей губок. Эти ультраструктурные отличия, с одной стороны, могут быть объяснены трудностью фиксации и пробоподготовки тканей губок для ультраструктурных исследований, а с другой стороны – они отражают особенности организации губок, которые совершенно не свойственны высшим многоклеточным животным (подробнее см. ниже) (Leys et al., 2009).

В ходе эмбриогенеза, личиночного развития, метаморфоза личинок, бесполого размножения и регенерации губок имеют место разнообразные движения отдельных клеток или клеточных пластов, изменения формы клеток, которые сходны с подобными явлениями в развитии высших многоклеточных животных (Ereskovsky, 2010; Ereskovsky et al.

, 2013). Так, в ходе эмбрионального развития губок распространены мезенхимальные морфогенезы – эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и мезенхимально-эпителиальная трансформация (МЭТ). Эпителиально-мезенхимальный переход представляет собой процесс перехода клеток из эпителиального состояние в мезенхимальное, связанный с разрушение межклеточных контактов и активной миграцией клеток. Мезенхимально-эпителиальная трансформация – это процесс противоположный ЭМП, проявляющийся как участие мезенхимальных клеток в формировании эпителиев (Ereskovsky et al., 2013).

Эпителиально-мезенхимальный переход наблюдается во время формирования личинок у некоторых представителей Demospongiae (например, униполярная или мультиполярная иммиграция у Halisarca dujardinii Johnston, 1842) (Рисунок 10А), а также на начальных этапах метаморфоза личинок губок (Рисунок 10Б). Мезенхимальноэпителиальная трансформация распространена у губок не так широко и, в основном, проявляется у представителей класса Homoscleromorpha в ходе формирования их личинок. У губок из других классов МЭТ принимает участие в формировании водоносной системы молодой особи во время метаморфоза (Рисунок 10Б) (Leys, Ereskovsky, 2006; Ereskovsky, 2010; Ereskovsky et al., 2013).

Эпителиальные морфогенезы также встречаются у губок, особенно у представителей Homoscleromorpha. У губок из этого класса во время эмбрионального развития наблюдаются множественные инвагинации эпителия предличинок (Рисунок 11А), инвагинация и эвагинация участвуют в формировании водоносной системы во время метаморфоза (Рисунок 11Б), закладка остий начинается с инвагинации экзопинакодермы, с эвагинации экзопинакодермы начинаются процессы почкования и роста (Ereskovsky, 2010; Ereskovsky et al., 2013). У представителей других классов губок эпителиальные мофрогенезы имеют место во время эмбрионального развитии (например, при экскурвации стомобластул у представителей класса Calcarea) (Рисунок 11В) (Ereskovsky, 2010; Ereskovsky et al., 2013), а также в ходе регенеративных процессов (Короткова, 1961, 1972б).

Исследования молекулярных основ функционирования тканей губок также обнаруживают значительные сходства этих животных с Eumetazoa. Одним из важнейших компонентов любой ткани является внеклеточный матрикс. В составе внеклеточного матрикса губок обнаружен ряд соединений, характерных для высших многоклеточных животных. Как и у представителей Eumetazoa, основу внеклеточного матрикса губок составляют коллагены разных типов (включая коллаген IV типа у представителей класса Homoscleromorpha). В составе матрикса также обнаружены гликозамингликаны, фибронектин, перлекан, нидоген, фибриллин, агрин, тромпоспондин, остеонектин и ламинин (Boute et al., 1996; Ereskovsky, 2010; zbek et al., 2010; Riesgo et al., 2014). При этом некоторые из этих соединений имеют специфические функции в тканях Eumetazoa (например, агрин и тромбоспондин участвуют в формировании синоптических контактов в нервной системе позвоночных), и их роль во внеклеточном матриксе губок не ясна. Губки обладают довольно развитой системой рецепторов, которые обеспечивают адгезию клеток с внеклеточным матриксом и клеток с клетками. Среди молекул, отвечающих у высших многоклеточных животных за адгезию клеток с внеклеточным матриксом, у губок были обнаружены интегрины, синдеканы, S-лектины, CD36 и разнообразные мембранные протеогликаны (Ereskovsky, 2010; zbek et al., 2010). За адгезию клеток с клетками у губок отвечают члены суперсемейства кадгеринов, иммуноглобуллин-подобные белки, клаудины и специфический для губок макромолекулярный комплекс – фактор агрегации (подробнее см. раздел 1.3) (Fernndez-Busquets, Burger, 1999; Mller, Mller, 2003; Nichols et al., 2006;

Ereskovsky, 2010; Srivastava et al., 2010; Riesgo et al., 2014).

У губок развита система межклеточного сигналлинга, отвечающая за передачу информации от клетки к клетке и обеспечивающая координированные взаимодействия клеток как внутри одной ткани, так и в разных тканях. Эта система включает в себя ряд веществ, которые у высших многоклеточных животных выполняют функции нейромедиаторов (ацетилхолин, эпинефрин, норэпинефрин, 5-окситриптамин, серотонин, -аминомаслянная кислота), а также ферменты, участвующие в синтезе нейромедиаторов (моноаминоксидаза, холинэстераза) (Ereskovsky, 2010;

Riesgo et al., 2014).

Несмотря на простую организацию губок, в контроле их эмбриогенеза принимает участие значительное количество регуляторов развития, которые характерны для Eumetazoa. Так, в геноме губок обнаружены гены многих классов транскрипционных факторов (ANTP, PRD, Pax, POU, LIM-HD, Six, HMG, nuclear receptor (NR), Fox, T-box, Mef2, Ets, IRO, bZIP, Zink finger C2H2) и элементов основных сигнальных путей (Wnt, TGF-, Notch-Delta, Hedgehog, Jak/STAT). Фактически в геноме губок присутствует гомологи всех основных регуляторов развития высших многоклеточных животных, но они представлены меньшим количество членов в семействах генов (Larroux et al., 2006;

Nichols et al., 2006; Srivastava et al., 2010; Ereskovsky et al., 2013; Riesgo et al., 2014).

1.1.4. Уникальные черты организации губок

В организации губок присутствуют черты, абсолютно нехарактерные для других многоклеточных животных. Уникальной чертой организации взрослых губок можно считать мобильность и пластичность их анатомических и клеточных структур (Gaino et al., 1995). В отличие от других многоклеточных животных, у которых активные клеточные движения и дифференцировки связаны, преимущественно, с процессами формирования структурных и функциональных элементов организма во время развития или с восстановительными морфогенезами, тело губок находится в состоянии постоянно идущей перестройки. Это приводит к непрерывной реорганизации основных анатомических структур тела животного – водоносной системы и скелета (Harris, 1987;

Bond, 1992). Губки способны быстро менять конфигурацию своей водоносной системы, что позволяет им наилучшим образом подстроить ее под текущие гидродинамические условия и поддерживать высокую эффективность фильтрации. Процессы реорганизации тканей также принимают участие и во многих других аспектах жизни губок, таких как

1) ростовые процессы, 2) регенерация, 3) восстановление тканей после деградации, вызванной половым размножением, 4) формирование структуры для бесполого размножения (почек или геммул), 5) движение (Harris, 1987; Bond, Harris, 1988; Gaino, Burlando, 1990; Bond, 1992; Gorin, Kosevich, 2009; Ereskovsky, 2010; Borisenko et al., 2015;

Ereskovsky et al., 2015).

В основе способности губок к реорганизации тканей лежит пластичность дифференцировок клеток и их высокая мобильность. Абсолютно все клетки в теле губок способны к активным движениям, и большинство из них способно к трансдифференцировкам, направление которых определяется текущими потребностями организма (Ereskovsky, 2010).

Похоже, в своей организации губки смогли найти баланс между очень высокой пластичностью всех структур в теле и интеграцией этих структур в единый организм.

Это требует наличия уникальных механизмов клеточной интеграции и коммуникации, отличных от таковых у других многоклеточных. В связи с этим невозможно обсуждать вопросы, касающиеся механизмов функционирования тканей многоклеточных животных, не принимая во внимание данные, полученные на представителях губок.

Реагрегация клеток губок 1.2.

Одной из форм проявления описанной выше пластичности тканей губок является способность их клеток к реагрегации после диссоциации тканей животного химическими или механическими методами. Впервые процесс реагрегации клеток губок был описан Уилсоном в 1907 году (Wilson, 1907) и с тех пор стал предметом исследования многих авторов. В ходе процесса реагрегации происходит формирование многоклеточных агрегатов разнообразного строения, а в некоторых случаях и полное восстановление организации губки (Ефремова, 1969, 1972; Короткова, 1972а;

Wilson, 1907, 1910; Huxley, 1912, 1921; Galtsoff, 1925b; Wilson, Penney, 1930). Эти процессы являются не простой “самосборкой” и сортировкой дифференцированных клеток. В ходе реагрегации клеток и последующего восстановления губки имеют место активные дедифференцировки и трансдифференцировки определенных клеточных типов, а судьба клеток, судя по всему, определяется их положением в многоклеточном агрегате (Ефремова, 1969, 1972; Короткова, 1972а, 1997; Никитин, 1973б; Волкова, Золотарева, 1981). Эти факты делают процесс реагрегации клеток удобной модельной системой, которая позволяет в контролируемых лабораторных условиях изучать многие детали функционирования тканей губок: поведение и взаимодействие различных клеточных типов, их способности к дедифференцировкам и трансдифференцировкам, пути восстановления исходных связей между клетками и формирования основных структурных элементов организма. Кроме того, долговременные культуры многоклеточных агрегатов в настоящее время рассматриваются как потенциальная система для получения биологически активных веществ из губок (Osinga, 1999; Mller et al., 2000; Pomponi, 2006).

1.2.1. Поведение клеток на ранних этапах реагрегации

Для получения суспензии клеток используют два основных метода диссоциации тканей губок – химический или механический. В случае механической диссоциации ткани животного протирают через мелкий мельничный газ, что приводит к их механическому разделению на отдельные клетки и небольшие группы клеток (Wilson, 1907; Ефремова, 1969). При химической диссоциации ткани губки помещают в безкальциевую и безмагниевую воду с хелатирующим компонентом (ЭДТА), что приводит к нарушению межклеточных контактов и разделению тканей на отдельные клетки (Humphreys, 1963; Custodio et al., 1998; Mller et al., 1999). Концентрированные суспензии клеток помещают в чашки Петри, получая, таким образом, временные культуры клеток, в которых будет происходить процесс реагрегации.

Процесс реагрегации начинается в суспензии клеток непосредственно после ее получения (если суспензия была получена химическим методом, то реагрегация начинается только после перенесения клеток в среду, содержащую ионы Ca2+ и Mg2+). В суспензии изолированные клетки быстро приобретают округлую форму. Исключение составляют хоаноциты, некоторое время сохраняющие жгутик и воротничок микроворсинок. Клетки в суспензии начинают формировать псевдоподии, число, размер и форма которых сильно варьируют (Языков, 1965а, б; Ефремова, Дроздов, 1970;

Ефремова, 1972; Короткова, 1972а; Волкова, Золотарева, 1981; Wilson, 1907; Huxley, 1912; Galtsoff, 1923, 1925a; Mookerjee, Ganguly, 1964; Noble, Peterson, 1972; Gaino et al., 1985, 1993; Gaino, Burlando, 1990; Gaino, Magnino, 1999).

После оседания на субстрат из толщи суспензии и формирования псевдоподий, клетки большинства видов губок приобретают амебоидную подвижность и в ходе своих перемещений встречаются с другими клетками и формируют агрегаты (Языков, 1965а, б; Ефремова, Дроздов, 1970; Ефремова, 1972; Короткова, 1972а; Wilson, 1907; Huxley, 1912; Galtsoff, 1923, 1925a; Mookerjee, Ganguly, 1964; Noble, Peterson, 1972;

Gaino et al., 1985, 1993; Gaino, Burlando, 1990; Gaino, Magnino, 1999). Уилсон, работавший на морской губке Clathria prolifera (Ellis & Solander, 1786) из класса Demospongiae, указывал, что амебоидной подвижностью обладают все типы клеток данного вида, хотя не проводил детального наблюдения за поведением клеток в суспензии (Wilson, 1907). Более подробные наблюдения за поведением клеток C. prolifera в суспензии были проведены Гальцовым (Galtsoff, 1923, 1925a). Гальцов выделял в суспензии три типа клеток – археоциты, покровные клетки (вероятно, пинакоциты) и хоаноциты. По его наблюдениям амебоидной подвижностью обладали только археоциты и покровные клетки (при этом археоциты перемещались более активно), а хоаноциты могли двигаться только некоторое время за счет биения жгутика.

Сходные данные о том, что не все типы клеток в суспензии обладают равной способностью к амебоидному движению, были также получены для ряда видов из классов Demospongiae и Calcarea. У всех изученных видов амебоциты были наиболее подвижным типом клеток, а другие типы клеток были менее подвижны или вообще неспособны к амебоидному движению (Языков, 1965а; Ефремова, Дроздов, 1970;

Ефремова, 1972; Короткова, 1972а; Никитин, 1973а; Mookerjee, Ganguly, 1964; Gaino, Magnino, 1999). Анализ движения диссоциированных клеток губок из рода Clatrina выявил не одинаковое поведение разных типов клеток в ходе перемещения. Так, для хоаноцитов характерна постоянная скорость движения 1 мкм/сек и сильно извитая траектория движения. В тоже время амебоциты демонстрируют бльший разброс скоростей движения (от 0,7 до 2,1 мкм/сек), а их траектории обычно более линейны (Gaino, Magnino, 1999). Кроме того, ряду исследователей в ходе экспериментов с суспензиями клеток Ephydatia fluviatilis (Linnaeus, 1759) удалось показать, что интенсивность псевдоподиальной активности и амебоидного движения разных типов клеток изменяется со временем (Ефремова, Дроздов, 1970; Никитин, 1973а).

На поведение клеток губок в суспензии значительное влияние оказывает субстрат.

Диссоциированные клетки губок рода Clatrina ведут себя не одинаково при оседании на стекло, ламинин, фибронектин или коллаген. Оседание на коллаген стимулирует формирование псевдоподий у клеток, что приводит к повышению их подвижности и ускоряет реагрегацию. Оседание на ламинин, напротив, приводит к прикреплению клеток к субстрату и снижению их подвижности. Оседание на фибронектин вызывает незначительное уменьшение количества псевдоподий и их длины, но не оказывает влияние на подвижность клеток и реагрегацию. Оседание на полилизин вызывает очень сильное распластывание клеток, но судя по строение псевдоподий, не лишает клетки способности к локомоции (Gaino et al., 1993; Gaino, Magnino, 1999).

При наблюдении за миграцией клеток C. prolifera Гальцов (Galtsoff, 1923, 1925a) указывает, что перемещение клеток происходит в случайном направлении, т.е. клетки не мигрируют целенаправленно одна к другой или в направлении большой группы клеток. В ходе миграции клетки часто меняют направление и скорость перемещения.

Однако математический анализ движения клеток Halisarca sp. (Noble, Peterson, 1972) и Clathrina sp. (Gaino et al., 1985), показал, что траектории движения клеток не случайны, но четкой цитотропии выявлено не было.

Судя по всему, при наличии в суспензии подвижных клеток реагрегация происходит преимущественно за счет случайных встреч этих клеток, которые приводят к объединению клеток в первые некрупные агрегаты. В некоторых случаях небольшие агрегаты сохраняют способность к движению за счет амебоидной активности входящих в их состав клеток. В дальнейшем агрегаты увеличиваются в размерах либо за счет включения в свой состав окружающих одиночных клеток, либо за счет слияния с другими агрегатами (Языков, 1965а, б; Ефремова, Дроздов, 1970; Ефремова, 1972;

Wilson, 1907; Galtsoff, 1923, 1925a; Mookerjee, Ganguly, 1964; Gaino, Burlando, 1990). На суспензиях клеток E. fluviatilis было показано, что через 40-60 минут после диссоциации способность отдельных клеток входить в состав уже сформировавшихся к этому времени агрегатов резко падает, и с этого момента увеличение агрегатов происходит в основном за счет слияния с другими агрегатами (Ефремова, Дроздов, 1970).

Для H. dujardinii Johnston, 1842 описан иной механизм реагрегации. Клетки этого вида губок в суспензии округляются и образуют псевдоподии, но не используют их для движения. Вместо этого, клетки с помощью псевдоподий обследуют пространство вокруг себя. При контакте псевдоподий соседних клеток, они подтягиваются друг к другу, формируя первые агрегаты (Волкова, Золотарева, 1981). Кроме того, тщательные наблюдения за клетками E. fluviatilis в суспензии выявили “смешанный” характер их поведения – большинство клеток образует псевдоподии для активного перемещения по субстрату, но часть клеток производит псевдоподиями только “поисковые” движения вокруг себя (Ефремова, Дроздов, 1970; Ефремова, 1972).

1.2.2. Молекулярный механизм реагрегации клеток

На молекулярном уровне реагрегация клеток губок происходит при участии внеклеточного комплекса, так называемого фактора агрегации. По своей химической природе фактор агрегации губок является протеогликан-подобным макромолекулярным комплексом (Fernndez-Busquets, Burger, 1999). Исследования на электронном и атомносиловом микроскопах показали, что факторы агрегации C. prolifera и Geodia cydonium (Jameson, 1811) имеют форму розетки: в ее центре находится ядро комплекса – кольцевая молекула гликозилированного белка диаметром 100-130 нм, от которой расходятся 16линейных молекул белков, соединенных с ядром посредством ковалентных и нековалентных связей (Fernndez-Busquets, Burger, 1999; Mller, Mller, 2003) (Рисунок 12А). Факторы агрегации Halichondria bowerbanki Burton, 1930, Suberites aurantiacus (Duchassaing & Michelotti, 1864) и Haliclona oculata (Pallas, 1766) имеют сходные размеры и структуру, но ядром комплекса является линейная молекула (Fernndez-Busquets, Burger, 1999).

Фактор агрегации переходит в раствор при диссоциации интактных тканей губки.

При реагрегации клеток он действует как своеобразный мостик, который соединяет соседние клетки, взаимодействуя с трансмембранным белком, называемым рецептором агрегации, что приводит к объединению этих клеток. В экспериментах с суспензиями клеток C. prolifera и H. oculata было продемонстрировано, что по мере реагрегации концентрация свободного фактора агрегации в среде падает, поскольку он связывается с поверхностями клеток (Moscona, 1968). Процесс реагрегации клеток посредством фактора агрегации является двухступенчатым и включает в себя Ca2+-зависимый и Ca2+независимый этапы. Поэтому для эффективной работы фактору агрегации необходимо наличие в среде ионов Ca2+ и Mg2+, а также полипептида галектина (Короткова, 1997;

Spiegel, 1954; Humphreys, 1963; Popescu, Misevic, 1997; Fernndez-Busquets, Burger, 1999;

Mller, Mller, 2003; Ereskovsky, 2007) (Рисунок 12Б).

Начальная концентрация фактора агрегации в среде влияет на степень реагрегации клеток губки: повышение его концентрации ведет к формированию более крупных агрегатов, понижение – к уменьшению размеров агрегатов или отсутствию агрегации (Humphreys, 1963; Moscona, 1968; Leith, 1979). Для протекания процесса реагрегации клетки губки необязательно должны быть метаболически активными. В присутствие фактора агрегации возможна реагрегация клеток, предварительно зафиксированных глютаровым или формалиновым альдегидом (Moscona, 1968; Leith, 1979), или реагрегация при низких температурах, когда метаболизм клеток блокирован (Humphreys, 1970; Popecsu, Misevic, 1997; Fernndez-Busquets, Burger, 1999). Однако в отсутствии самого фактора агрегации или при его блокировании (иммунной сывороткой или поликлональными антителами) реагрегация клеток не происходит (Spiegel, 1954;

Humphreys, 1963; Popecsu, Misevic, 1997; Fernndez-Busquets, Burger, 1999).

1.2.3. Видовая и индивидуальная специфичность реагрегации клеток

Для ряда видов губок известно, что в ходе процесса реагрегация их клетки проявляют способность к видоспецифичной агрегации. В этом случае при смешивании суспензий клеток, полученных от двух разных видов губок, реагрегация происходит только между клетками и многоклеточными агрегатами одного вида. Клетки разных видов не реагрегируют, даже если они искусственно сближены посредством центрифугирования (Wilson, 1910; Galtsoff, 1923, 1925a; Curtis, 1962; Humphreys, 1963, 1970; Fernndez-Busquets, Burger, 1999).

Эксперименты Хамфриса (Humphreys, 1963, 1970) со смешанной суспензией клеток C. prolifera и H. oculata показали, что для данных видов характерна высокая видоспецифичность реагрегации, и в культурах никогда не формируются смешанные агрегаты. При удалении из смешанной суспензий клеток факторов агрегации обоих видов реагрегации клеток не происходит. Если после этого к суспензии добавить фактор агрегации одного из видов, то происходит формирование агрегатов из клеток только этого вида. Сходные эксперименты были проведены Шпигелем (Spiegel, 1954) на смешанной суспензии клеток C. prolifera и Cliona celata Grant, 1826, для которых также характерна высокая видоспецифичность реагрегации. Однако в своих экспериментах Шпигель не удалял факторы агрегации из смешанной суспензии клеток, а блокировал их с помощью иммунных сывороток. Добавление иммунной сыворотки против фактора агрегации одного из видов останавливало реагрегацию только клеток этого вида, никак не влияя на процесс реагрегации клеток другого вида.

Эти данные, а также результаты аналогичных экспериментов других исследователей (Moscona, 1968; Leith, 1979), указывали на видоспецифичный характер действия фактора агрегации и позволили выдвинуть предположение о его участии в процессе видоспецифичной реагрегации клеток губок. Эти предположения были полностью подтверждены в экспериментах с цветными синтетическими гранулами, которые были соединены с факторами агрегации трех видов губок (С. prolifera, Halichondria panicea (Pallas, 1766) и C. celata). При наличии в среде ионов Ca2+ в этой экспериментальной системе происходит видоспецифичная агрегация гранул, что однозначно указывает на центральную роль фактора агрегации в процессе видоспецифичной реагрегации клеток губок (Popescu, Misevic, 1997; Fernndez-Busquets, Burger, 1999; Fernndez-Busquets, 2008).

Тем не менее, в ряде экспериментов со смешанными суспензиями клеток не происходит полного разделения клеток разных видов, и формируются смешанные агрегаты различного строения (Curtis, 1962; Humphreys, 1970; Leith, 1979). Это указывает на то, что, по крайней мере, у некоторых губок видоспецифичность реагрегации выражена не так ярко. Кёртису (Curtis, 1962) в экспериментах с несколькими видами губок удалось наблюдать весь спектр возможных результатов реагрегации смешанной суспензии клеток – от полного разделения клеток разных видов до формирования агрегатов, в которых клетки двух видов были случайно перемешаны.

При этом полное разделение клеток двух видов губок происходило, если темп реагрегации у этих видов сильно различался. В случае сходного темпа реагрегации в смешанной суспензии двух видов формировались смешанные агрегаты. Эти данные позволяют предположить, что видовая специфичность реагрегации клеток определяется не только видоспецифичностью действия фактора агрегации, но и временнй компонентой.

На разных клональных линиях пресноводной губки E. fluviatilis было показано, что реагрегирующие клетки проявляют не только видовую специфичность, но и индивидуальную.

При смешивании суспензий клеток, полученных из представителей разных клональных линий, на ранних этапах реагрегации формируются смешанные агрегаты. Но в течение нескольких суток в этих агрегатах происходит сортировка клеток, которая приводит к полному разделению клеток, принадлежащих разным линиям. То есть формируются агрегаты, состоящие из клеток только одного индивидуума (Van de Vyver, 1975; Fernndez-Busquets, Burger, 1999). Индивидуальная специфичность сохраняется и при смешивании клеточных фракций, которые состоят только из одного типа клеток (De Sutter, Van de Vyver, 1979; Fernndez-Busquets, Burger, 1999).

Хотя до сих пор неясно, какой механизм лежит в основе индивидуальной специфичности и гистосовместимости у губок, некоторые факты указывают на участие в этом процессе фактора агрегации. (1) В упомянутых выше экспериментах на E. fluviatilis было показано, что добавление в среду фактора агрегации одной из клональных линий вызывает усиленную реагрегацию клеток только своей линии и подавляет этот процесс у клеток других линий (Van de Vyver, 1975). (2) Исследования значительного количества особей C. prolifera показали, что каждая особь имеет разный набор генов, кодирующих белки MAFp3 и MAFp4, которые формируют ядро в молекуле фактора агрегации. Индивидуальная вариабельность наблюдается и на уровне углеводов, входящих в состав фактора агрегации. Такой высокий внутривидовой полиморфизм характерен для молекулярных систем, участвующих в аллогенном распознавании у высших многоклеточных животных (Fernndez-Busquets, Burger, 1997,1999; Fernndez-Busquets et al., 1998; Fernndez-Busquets, 2008). (3) В экспериментах по аллогенной трансплантации на C. prolifera было показано накопление мРНК MAFp3, а также самого белка в клетках на границе тканей донора и реципиента (Fernndez-Busquets et al., 1998, 2002).

–  –  –

Процесс реагрегации клеток губок изучали на представителях двух классов:

Demospongiae и Calcarea. Однако на известковых губках было проведено лишь небольшое количество исследований (Короткова, 1972а; Huxley, 1912, 1921). Было показано, что на ранних этапах скорость реагрегации клеток отличается у представителей Demospongiae и Calcarea. Если у Leucosolenia complicata (Montagu, 1814) и Sycon lingua (Haeckel, 1870) (Calcarea) первые многоклеточные агрегаты, состоящие из 15-30 клеток, образуются только через 2-3 часа после начала реагрегации, то у губок класса Demospongiae агрегаты такого же размера формируются уже через 15-40 минут.

Во всех случаях первые многоклеточные агрегаты имеют небольшие размеры и неправильную форму (Рисунок 13А). В дальнейшем происходит увеличение их размеров за счет слияния агрегатов друг с другом, а также за счет дальнейшего присоединения к ним отдельных клеток из суспензии. Через 2-4 часа многоклеточные агрегаты у представителей класса Demospongiae достигают размеров сотен микрометров (в некоторых случаях 1-1,5 мм). У представителей класса Calcarea для достижения тех же размеров агрегатам требуется 12-24 часа (Короткова, 1972а; Sipkema et al., 2003;

Zhang et al., 2003a; Chernogor et al., 2011a, 2015), что, возможно, связано с меньшей амебоидной подвижностью клеток в суспензии.

На 1–3-е сутки в культурах появляются агрегаты, имеющие округлую форму и неровную поверхность (Рисунок 13Б). Данная стадия реагрегации носит название ранние примморфы. Ранние примморфы постепенно преобразуются в настоящие примморфы (Рисунок 13В). Процесс преобразования ранних примморфов сопровождается уплотнением многоклеточных агрегатов и формированием на их поверхности сплошного слоя экзопинакодермы (первые этапы формирования экзопинакодермы в некоторых случаях наблюдаются спустя несколько часов после начала реагрегации) (Mller et al., 1999; Sipkema et al., 2003; Zhang et al., 2003a; Chernogor et al., 2011a;

Ereskovsky et al., 2016). В процессе преобразования первичных многоклеточных агрегатов в примморфы вокруг них часто образуется зона, в которой лежат детрит, мертвые клетки и спикулы, вероятно, выделяемые самими агрегатами (Mller et al., 1999; Sipkema et al., 2003) (Рисунок 13Г).

Исследование ряда видов средиземноморских губок, относящихся к классу Demospongiae, показало, что у 14 видов примморфы формируются на 3–7-е сутки, у 5 видов – на 8–20-е сутки, у 1 вида – на 35–40-е сутки и у еще 8 видов примморфы не формируются – агрегация доходит только до стадии многоклеточных агрегатов (Sipkema et al., 2003; Valisano et al., 2006a). Время формирования примморфов сильно варьирует у разных видов, в основном за счет различий в скорости преобразования ранних примморфов в настоящие примморфы (Sipkema et al., 2003). Сильно варьирует и время существования примморфов разных видов губок в культуре – от 6 дней до 10 месяцев (Mller et al., 1999; Sipkema et al., 2003; Valisano et al., 2006a; Chernogor et al., 2011a) (Таблица 1). Среди причин того, что у некоторых видов губок реагрегация клеток не приводит к формированию примморфов, называются анатомические и экологические особенности данных видов. Предполагается, что у губки рода Cliona формированию примморфов может препятствовать седиментарный материал, накапливающийся в хоаноцитных камерах губки в результате сверлящей активности, а в случае Aplysina формированию примморфов препятствует огромное количество aerophoba симбиотических бактерий (Valisano et al., 2006a). Однако четкого обоснования этих предположений в указанных работах не приводится.

Валисано с коллегами (Valisano et al., 2006a), проводившие исследования процесса реагрегации на ряде видов средиземноморских губок, указывают, что примморфы, получаемые от разных видов губок, различаются по форме, размеру и общему числу в культуре, даже если для их формирования используют один и тот же объем тканей. При этом не наблюдается корреляции между закономерностями формирования примморфов и таксономическим положением губки. Подобные выводы выглядят не совсем корректными, так как реальное влияние на динамику процесса реагрегации оказывает не столько объем используемых тканей, сколько концентрация клеток в суспензии, получаемой после диссоциации этих тканей. К сожалению, в своей статье авторы не указывают концентрации клеток в используемых суспензиях. Вместе с тем, авторы предполагают, что различия в количестве и размерах примморфов могут быть объяснены различным “поведением” примморфов после их окончательного формирования: 1) примморфы сливаются, при этом их количество уменьшается, а размеры увеличиваются; 2) примморфы дробятся, и их количество увеличивается, а размеры уменьшаются (Valisano et al., 2006a). Все эти данные и рассуждения говорят в пользу существования нескольких возможных путей реагрегации клеток губок.

В целом динамику реагрегации клеток можно представить следующим образом (Valisano et al., 2006a) (Рисунок 14):

1. Диссоциированные клетки;

2. Многоклеточные агрегаты;

–  –  –

Особый тип реагрегации был продемонстрирован на губке Dysidea avara (Schmidt, 1862). После образования настоящих примморфов реагрегация продолжилась

– на 10-е сутки культивирования примморфы начали сливаться, образуя сеть, которая прикреплялась ко дну чашки Петри (Рисунок 15). Эта сеть достигла размеров 10-30 х 5-20 мм, при толщине “столонов” ~50 мкм и размерах пор ~150 мкм (Mller et al., 2000).

К сожалению, дальнейшая судьба данного типа агрегатов не была описана.

1.2.5. Гистологическое строение многоклеточных агрегатов и примморфов

Многоклеточные агрегаты, формирующиеся в первые часы после диссоциации, включают все типы клеток, присутствовавших в суспензии. На начальной стадии клетки в составе агрегатов упакованы неплотно. Форма клеток близка к округлой, реже они образуют цитоплазматические отростки для взаимодействия с соседними клетками.

Часть клеток содержит в своей цитоплазме фагосомы. Клетки, располагающиеся на поверхности многоклеточных агрегатов, не отличаются по морфологии от клеток, лежащих глубже (Рисунок 16А). В состав агрегатов также могут входить обломки спикул, тяжи спонгина и коллагена, а также симбиотические бактерии и одноклеточные водоросли, которые присутствовали в тканях материнской губки (Ефремова, 1969;

Короткова, 1972а; Волкова, Золотарева, 1981; Chernogor et al., 2011a, 2014; Ereskovsky et al., 2016). Остается непонятным, что позволяет клеткам держаться вместе: обычные методы фиксации для электронной микроскопии не выявляют никакого внеклеточного матрикса, а видимых точек контактов между клетками явно недостаточно.

Во время преобразования многоклеточных агрегатов в примморфы происходит изменение их строения.

В основном изменения касаются поверхностного слоя клеток:

эти клетки приобретают уплощенную или Т-образную форму, и постепенно формируют непрерывный слой экзопинакодермы на поверхности примморфа (Рисунок 16Б, В) (Ефремова, 1969; Короткова, 1972а; Волкова, Золотарева, 1981; Custodio et al., 1998;

Mller et al., 1999; Sipkema et al., 2003; Chernogor et al., 2011a; Ereskovsky et al., 2016). В это время также меняется распределение волокон коллагена внутри агрегата. Если через 24 чпд (часы после диссоциации) в первичных многоклеточных агрегатах волокна коллагена немногочисленны и распределены случайным образом, то к моменту формирования примморфов коллагеновые фибриллы заполняют межклеточное пространство, а на поверхности примморфов образуют сплошной слой, который, вероятно, обеспечивает механическую поддержку слою экзопинакоцитов (Vilanova et al., 2010). На поверхности примморфов E. fluviatilis, в отличие от других видов губок, формируется двойной слой пинакоцитов, который в некоторых местах отделяется от внутренней массы клеток и образует гиподермальные полости (Ефремова, 1969).

Постепенно клетки внутренней массы примморфов приобретают довольно плотную упаковку. Они характеризуются полигональной формой, и большинство из них может быть определено как амебо- и археоциты. Реже во внутренней массе встречаются лофоциты (Vilanova et al., 2010) или разнообразные клетки с включениями, ультраструктура которых напоминает таковую клеток в интактных тканях губок (Короткова, 1972а; Custodio et al., 1998; Mller et al., 1999; Le Pennec et al., 2003;

Chernogor et al., 2011a; Ereskovsky et al., 2016) (Рисунок 16В). Несмотря на плотную упаковку клеток в составе примморфов между ними не были обнаружены специфические межклеточные контакты – цитоплазматические мембраны соседних клеток расположены параллельно друг другу, но разделены небольшим расстоянием.

–  –  –

Как показали исследования, физиологическое состояние клеток в составе многоклеточных агрегатов и примморфов отличается от такого в интактных тканях губок.

Исследование уровня теломеразной активности у Suberites domuncula (Olivi, 1792) показало, что в примморфах он довольно высокий по сравнению с клетками, находящимися в суспензии, но гораздо ниже, чем клетках интактных тканей губки.

Теломеразная активность в интактных тканях составляет 8.9 единиц TPG (total product generated) на 5х103 клеток. В клетках, которые находились в суспензии 14 часов, теломеразная активность падает до 0.9 единиц TPG на 5х103 клеток. В примморфах (10 суток после формирования из отдельных клеток) теломеразная активность возрастает до

4.7 единиц TPG на 5х103 клеток (Custodio et al., 1998; Mller et al., 1999).

Теломеразная активность клеток в составе примморфов свидетельствует о том, что они сохраняют способность к митотическим делениям. Исследования митотической активности клеток на разных стадиях процесса реагрегации S. domuncula с использованием BrdU-метки (5-бромо-2'-деокси-уридин) показали, что клетки, которые находились в суспензии 24 часа, не претерпевают митотических делений.

Многоклеточные агрегаты, полученные через 24 часа культивирования, содержали 6,5% делящихся клеток. В примморфах количество делящихся клеток зависело от возраста примморфа. Так, в трехдневных примморфах количество делящихся клеток составляло 33,8%, а в примморфах возрастом 1 месяц – 22,3%. Эти данные указывают на то, что клетки в примморфах S. domuncula синтезируют ДНК и, вероятно, претерпевают клеточные деления (Custodio et al., 1998; Mller et al., 1999).

Способность клеток примморфов к синтезу ДНК и, возможно, к митотическим делениям, указывает на то, что эти многоклеточные агрегаты имеют предпосылки для роста и прогрессивного развития. Тем не менее, наблюдения показали, что при длительном культивировании примморфов Petrosia ficiformis (Poiret, 1789) не происходит увеличения биомассы. Сухой вес примморфов после 20 дней культивирования примерно в 10 раз меньше сухого веса участка тела губки того же объема, что был использован для получения этих примморфов. В ходе этого эксперимента примморфы культивировали в фильтрованной морской воде без добавления каких-либо питательных компонентов (Valisano et al., 2006b).

Примморфы, как и нормальные особи губок, способны к синтезу биологически активных веществ. Уже после 3-6 суток культивирования в экстрактах примморфов D. avara наблюдается значительное количество аварола – 0,4 – 0,9 мкг на 100 мкг тканей.

Это составляет примерно 30% от содержания аварола в тканях интактной губки.

Содержание аварола в клетках значительно увеличивается после формирования сетчатых примморфов, достигая 1,4 мкг на 100 мкг тканей (80% от содержания аварола в тканях губки) (Mller et al., 2000).

Кроме того, в многоклеточных агрегатах может происходить синтез полисахаридов и коллагена de novo, как это показано для Hymeniacidon heliophila (Parker, 1910). Синтез полисахаридов у многоклеточных агрегатов этого вида наиболее активен в первые сутки реагрегации и падает практически до нуля к моменту формирования примморфов (4-5 сутки). По мнению авторов, эти результаты указывают на важную роль полисахаридов в клеточной адгезии у губок, в частности, на ранних этапах реагрегации клеток (Vilanova et al., 2010). Изменения интенсивности синтеза коллагена в ходе развития агрегатов пока не изучены.

При определенных условиях культивирования (см. раздел 1.8), а также при прогрессивном развитии, связанном с реконструкцией исходной организации губки, в примморфах начинается активный синтез новых спикул, которые имеют характерную для данного вида губки форму и размеры (Короткова, 1972а; Никитин, 1973б; Черногор и др., 2014; Le Pennec et al., 2003; Cao et al., 2007a, 2007b; Valisano et al., 2007a;

Chernogor et al., 2011b).

–  –  –

На процесс реагрегации клеток, а также на размеры получаемых многоклеточных агрегатов, их количество, структуру и физиологию влияет множество различных факторов.

Физиологическое состояние губки. Физиологическое состояние особи, клеточный материал которой используется для экспериментов, оказывает существенное влияние на протекание процесса реагрегации. Долгое (более 14 суток) содержание губки в аквариуме перед проведением экспериментов негативно отражается на реагрегации клеток. Как результат – в суспензиях клеток, полученных от таких особей, происходит формирование только мелких многоклеточных агрегатов, не способных к дальнейшему прогрессивному развитию и погибающих в течение нескольких суток (Galtsoff, 1925a;

Valisano et al., 2006b). Это можно объяснить общим ухудшением состояния губок при длительном содержании в простых аквариальных системах.

Существенным фактором является и стадия репродуктивного цикла губки. На E. fluviatilis показано, что с наибольшей эффективностью процесс реагрегации протекает в суспензиях клеток, полученных от особей, которые только приступили к половому размножению или геммулогенезу. Если же в экспериментах используются особи, уже активно формирующие геммулы, начальные этапы реагрегации клеток идут очень быстро, но затем наблюдается замедление морфогенезов, связанных с прикреплением к субстрату и формированием водоносной системы. При использовании клеточного материала молодых особей губки в культурах клеток формируются только очень мелкие агрегаты, состоящие преимущественно из хоаноцитов и не способные к дальнейшему развитию (Ефремова, 1969, 1972; Короткова, 1997). Реагрегация клеток H.

dujardinii наиболее успешно идет перед началом полового размножения. В этом случае происходит восстановление исходной организации губки. В культурах клеток, полученных от особей этого вида в период полового размножения или непосредственно после него, происходит лишь формирование примморфов, но восстановления исходной организации губки никогда не наблюдается (Волкова, Золотарева, 1981).

Криоконсервация суспензии клеток. В большинстве случаев эксперименты по реагрегации клеток губок лучше проводить со свежеполученной суспензией клеток. Тем не менее, возможно использование криоконсервации клеток. На суспензиях клеток нескольких видов из класса Demospongiae было показано, что криоконсервация незначительно снижает жизнеспособность клеток. Так, свежеполученные суспензии клеток изученных видов содержат 80-100% живых археоцитов. После криоконсервации в 15% растворе DMSO количество живых археоцитов снижается до 70-95% (Pomponi, 2006). Однако для P. ficiformis было показано, что после криоконсервации ее клетки не способны формировать примморфы. Реагрегация доходит только до стадии многоклеточных агрегатов. Криоконсервация уже сформировавшихся примморфов этого вида дает лучшие результаты – после разморозки примморфы полностью сохраняют жизнеспособность. Их размеры и форма не меняются, но они становятся более блеклыми, что, по мнению авторов, связано с гибелью части симбиотических цианобактерий. Кроме того, криоконсервация практически не влияет на теломеразную активность клеток в составе примморфов, но значительно повышает интенсивность спикулогенеза (Mussino et al., 2013).

Клеточный состав суспензии. Суспензию клеток, полученную путем диссоциации тканей губки, можно разделить на размерные фракции путем ее центрифугирования в ступенчатых или непрерывных плотностных градиентах.

Размерные фракции представляют собой или чистые фракции клеток определенного типа, или фракции, обогащенные каким-либо типом клеток.

Например, фракционирование суспензии клеток морской губки Hymeniacidon perlevis (Montagu, 1818) позволяет получить 3 фракции клеток: С1 – фракция, обогащенная мелкими клетками (80% составляют клетки менее 2 мкм в диаметре); С2 – фракция, содержащая смесь из клеток всех размерных классов; С3 – фракция, обогащенная крупными клетками (76% составляют клетки 10-15 мм в диаметре, которые можно охарактеризовать как археоциты и археоцитоподобные клетки) (Zhang et al., 2003b). Попытки получить примморфы из клеток отдельных фракций показали, что способностью к образованию примморфов обладала только фракция крупных клеток С 3.

При использовании этой фракции примморфы формировались уже на 2-е сутки, в то время как при использовании обычной суспензии клеток, полученной от того же экземпляра губки, примморфы формировались только на 4–5-е сутки. Кроме того, примморфы, полученные из фракции крупных клеток С3, обладали более правильной и гладкой формой и на протяжении всего эксперимента демонстрировали более высокий уровень синтеза ДНК по сравнению с обычными примморфами (Zhang et al., 2003b) (Рисунок 17).

В суспензии клеток пресноводной губки E. fluviatilis удается выделить следующие фракции клеток (De Sutter, Van de Vyver, 1977, 1979; Buscema et al., 1980): А1 – чистая фракция археоцитов; B2+3 – фракция, включающая все типы клеток губки, кроме археоцитов; С2 – фракция, обогащенная хоаноцитами; С3 – фракция, включающая все типы клеток губки, кроме археоцитов и хоаноцитов.

Процесс реагрегации клеток во фракции А1 ведет к формированию примморфов через 24 часа и к дальнейшему восстановлению исходной организации губки через 2–3е суток (De Sutter, Van de Vyver, 1977; Buscema et al., 1980). Авторы не проводили сравнения темпов реагрегации в данной фракции и в обычной суспензии клеток, полученной от той же особи. Вместе с тем, данные Ефремовой о темпах реагрегации обычной суспензии клеток этого вида свидетельствуют, что, как и у H. perleve, археоцитная фракция клеток E. fluviatilis проявляет ускоренный темп реагрегации (Ефремова, 1969).

Во фракции B2+3 процесс реагрегации доходит только до стадии примморфов.

Дальнейшего восстановления губки не происходит. Клетки во фракции С2 агрегируют быстрее, по сравнению с клетками других фракций, но процесс реагрегации доходит только до стадии многоклеточных агрегатов, которые погибают через несколько суток после своего формирования. Фракция С3 не обладает способностью к реагрегации (De Sutter, Van de Vyver, 1977, 1979).

Короткова для изучения влияния клеточного состава суспензии на процесс реагрегации клеток производила сборку многоклеточных агрегатов с помощь микроманипуляторов. В результате были получены искусственные многоклеточные агрегаты, в состав которых входил только один тип клеток губки. Было показано, что агрегаты, состоящие только из пинакоцитов или хоаноцитов, не способны к преобразованию в функциональную губку. Агрегаты из археоцитов проявляют бльшие морфогенетические потенции и способны восстановить исходную организацию животного в течение 6-7 суток (Короткова, 1997; Korotkova, 1979).

Приведенные данные указывают, что различные типы клеток губок обладают неодинаковыми морфогенетическими потенциями и способностью к дедифференцировке и трансдифференцировке, а также к индукции восстановительных процессов.

Концентрация клеток в суспензии. Исходя из общих соображений, можно предположить, что концентрация клеток в суспензии должна влиять на процесс реагрегации. И в самом деле, исследование, проведенное на S. domuncula, показало, что при использовании бльшей начальной концентрации клеток формируются более крупные примморфы. Так, увеличение концентрации клеток в суспензии в 3 раза (с 2107 кл/мл до 6107 кл/мл) привело почти к трехкратному увеличению размеров примморфов (Sipkema et al., 2003). У Hymeniacidon agminata Ridley, 1884 при повышении концентрации клеток увеличивается не только размеры примморфов, он и возрастает скорость их формирования (Zhang et al., 2003a). Влияние концентрации клеток в начальной суспензии на скорость формирования и размеры примморфов в первую очередь должно проявляться у видов губок, разрозненные клетки которых не обладают амебоидной подвижностью.

Температура. Влияние температуры на реагрегацию клеток губок неоднозначно.

Для суспензий клеток H. agminata (вид из Южно-Китайского моря; до начала экспериментов губок содержали в аквариуме при температуре 24-26°С) оптимальной является высокая температура. При 30°С примморфы данного вида губки появляются уже через 24 часа, при 25°С на этот процесс требуется 2-3-е суток, а при 15°С примморфы вообще не формируются (Zhang et al., 2003a).

Противоположные результаты получены в исследованиях, проведенных на примморфах P. ficiformis (вид из Средиземного моря; до начала экспериментов губок содержали в аквариуме при температуре 12°С) и Lubomirskia baicalensis (Pallas, 1773) (вид из оз. Байкал; до начала экспериментов губок содержали в аквариуме при температуре 3-4°С) – оптимальной для реагрегации оказалась низкая температура. Так, в культурах P. ficiformis при 12°С размеры примморфов составили 0,1 мм2, а при 24°С – 0,04 мм2. Кроме того, в первую неделю культивирования при 24°С наблюдалась высокая смертность примморфов (Valisano et al., 2007b). Для L. baicalensis оптимальной была температура 3-6°С – при данной температуре происходило активное образование примморфов, и они долгое время сохраняли жизнеспособность. При 12°С формирование примморфов происходило медленнее, кроме того, многие примморфы погибали через несколько дней после начала экспериментов. При температуре 18°С реагрегацию клеток L. baicalensis наблюдали только в первые часы, после чего клетки погибали (Chernogor et al., 2011a).

Очевидно, температура, оптимальная для процесса реагрегации клеток, напрямую связана с экологическими условиями, в которых обитают соответствующие виды губок.

Культуральная среда. Обычно в качестве культуральной среды для культивирования клеток губок используют стерилизованную фильтрацией пресную или морскую воду. Но часто для успешного долговременного содержания культур примморфов в культуральную среду добавляют антибиотики и фунгициды для предотвращения чрезмерного размножения бактерий и появления грибковых заражений, которые оказывают негативное влияние на процесс реагрегации клеток губок. Однако разные антибиотики и фунгициды оказывают на культуру примморфов неодинаковое воздействие. Так, добавление в культуральную среду пенициллина, гентамицина, рифампицина, стрептомицина или смеси пенициллина-стрептомицина заметно не влияет на реагрегацию клеток (Sipkema et al., 2003; Pomponi, 2006). Тем не менее добавление смеси четырех антибиотиков (канамицина, тулозина, тетрациклина, гентамицина) ингибирует формирование примморфов у 7 средиземноморских видов губок (S. domuncula, G. cydonium, Suberites massa Nardo, 1847, Pseudosuberites aff. andrewsi, H. panicea, H. oculata, Axinella polypoides Schmidt, 1862). В присутствии этих антибиотиков формируются только аморфные многоклеточные агрегаты. Возможно, негативное влияние связано со слишком высокой концентрацией антибиотиков в этой смеси – концентрации тилозина и тетрациклина были превышены в 10 раз по сравнению с рекомендациями производителя (Sipkema et al., 2003).

Приведенные данные представляют дополнительный интерес, если принять во внимание, что все виды губок образуют тесные и специфические симбиотические ассоциации с бактериями. Многие губки населены сложным микробным сообществом, которое может составлять до 40 % от массы тела животного. Симбиотические бактерии принимают участие в утилизации продукты обмена губок, передают им питательные вещества или производят вторичные метаболиты для химической защиты хозяина от хищников и обрастателей (Кутерницкая и др., 2008; Haygood et al., 1999; Lee et al., 2001;

Thakur et al., 2003). Также было показано, многие метаболиты, в том числе и потенциальные биологически активные вещества, представляют собой продукт совместной жизнедеятельности клеток губок и симбиотических бактерий (Mller et al., 2004a).

Вполне возможно, элиминация симбиотических бактерий из клеток суспензии при добавлении антибиотиков в культуральную среду может препятствовать полноценной реагрегации клеток и дальнейшему восстановлению структуры губки.

Подобные данные были получены при исследованиях реагрегации клеток H. dujardinii.

В культурах клеток этого вида губок процесс реагрегации полностью останавливается, если непосредственно после получения суспензии в культуральную среду добавляют антибиотик ампициллин. В таких культурах не происходит формирования ни многоклеточных агрегатов, ни примморфов. Если же добавление антибиотика происходит через 20-30 минут после начала культивирования суспензии клеток, то формирование многоклеточных агрегатов и примморфов идет нормально и внешне не отличается от контроля (реагрегация клеток в среде без антибиотика). По мнению авторов исследования, такой результат экспериментов говорит о том, что начальный период реагрегации клеток является важнейшим для определения дальнейшего взаимодействия клеток губок и их симбиотических бактерий (Кутерницкая и др., 2008).

Из сказанного выше ясно, что для успешного долговременного содержания примморфов, необходимо проводить подбор оптимального набора и дозы антибиотиков для каждого конкретного вида губки. При этом следует обращать внимание не только на эффективность антибиотика в подавлении микробного заражения, но и на характер его влияния на клетки губок. Кроме того, полноценное функционирование клеток губок, судя по всему, практически невозможно без симбиотических бактерий. Этот факт также следует учитывать при подборе условий для долговременного культивирования примморфов, а также при постановке экспериментов, связанных с восстановлением полноценной особи губки из суспензии клеток.

Применение фунгицида амфотерицина оказывает негативное влияние на реагрегацию клеток. Причиной подобного влияния является механизм действия данного фунгицида: афотерицин разрушает клетки грибов путем присоединения к основному стеролу их клеточных мембран – эргостеролу. Биохимические исследования нескольких видов губок (D. avara, Ircinia pipetta (Schmidt, 1868), Spongionella gracilis (Vosmaer, 1883), Tethya aurantium (Pallas, 1766)) показали, что эргостерол присутствует в мембранах их клеток. Более того, эргостерол является основным стеролом клеточных мембран у D. avara, I. pipetta и S. gracilis (Sipkema et al., 2003, 2004).

Подбор подходящего состава культуральной среды может увеличить продолжительность жизни многоклеточных агрегатов и примморфов в культуре и интенсифицировать метаболизм клеток в их составе. В результате это может обеспечить увеличение биомассы в культуре, более быстрое развитие примморфов в функциональных губок и усиление продукции биологически активных веществ. К настоящему времени большая часть исследований, направленных на создание культуральной среды для клеток губок, были выполнены на культурах диссоциированных клеток. Тем не менее, ряд подобных исследований был проведен и на примморфах.

На культурах примморфов некоторых видов губок изучали влияние добавления в культуральную среду ионов кремния и железа. Основаниями для таких экспериментов послужили данные о том, что ионы железа и кремний интенсифицируют синтез ДНК и белков в клетках губок, а также усиливают спикулогенез (Krasko et al., 2002). Однако результаты, полученные на разных видах губок, довольно противоречивы. Так, добавление 60 мкМ ионов кремния в культуру примморфов S. domuncula вызвало увеличение их размеров в три раза (с 2 мм до 6 мм). Последующее добавление 30 мкМ ионов железа вызвало дополнительное увеличение размеров примморфов до 10 мм и развитие каналов водоносной системы (Le Pennec et al., 2003).

В то же время, добавление 60 мкМ ионов кремния и 30 мкМ ионов железа в культуру примморфов P. ficiformis вызывало лишь слабый эффект, а увеличение концентрации ионов железа до 60 мкМ приводило к разрушению агрегатов в течение нескольких недель. Наиболее выраженный положительный эффект вызывало добавление в среду только ионов кремния в концентрациях 120 мкМ или 180 мкМ (Valisano et al., 2007a).

Добавление в среду только ионов кремния или ионов железа и кремния вызывало спикулогенез у примморфов двух упомянутых выше видов, а также у примморфов пресноводной губки L. baicalensis. В случае P. ficiformis увеличивалось не только количество спикул, но их размеры (Черногор и др., 2014; Krasko et al., 2002;

Le Pennec et al., 2003; Valisano et al., 2007a; Chernogor et al., 2011b).

Механизм влияния ионов железа и кремния на увеличения размеров агрегатов остается неясным. Развитие каналов может быть связано с недостатком кислорода при увеличении размеров примморфов. Водоносная система в этом случае служит для доставки кислорода к тканям агрегата (Le Pennec et al., 2003). Вместе с тем нет данных о фоновых значениях концентраций ионов железа и кремния в изначальной культуральной среде, и рассматривалось влияние лишь добавленных концентраций этих элементов.

На культурах диссоциированных клеток морских губок было показано, что добавление в среду пирувата, витамина C, хлорида натрия и ионов железа вызывает значительное увеличение жизнеспособности клеток (Zhang et al, 2004; Zhao et al., 2005;

Pomponi, 2006; de Caralt et al., 2007). Положительное влияние на жизнеспособность клеток и на интенсивность их метаболизма (уровень синтеза ДНК и белков, активность эстеразы) оказывает добавление в среду некоторых факторов роста и гормонов (фитогемагглютинина, инсулина, эпидермального фактора роста, простогландина E2), а также культивация клеток губок в разбавленных коммерческих средах, которые обычно используются для культивации клеток млекопитающих (Osinga et al., 1999; Pomponi, 2006; de Caralt et al., 2007).

Совершенно очевидно, что состав культуральной среды оказывает значительное влияние на процесс реагрегации клеток губок. Однако, несмотря на то, что изучению данной проблемы посвящено довольно много работ, многие полученные результаты неоднозначны и варьируют от эксперимента к эксперименту или от объекта к объекту.

–  –  –

Несмотря на более чем столетнюю историю изучения реагрегации клеток у губок, взгляды исследователей на морфогенетический потенциал примморфов сильно различаются.

В ранних работах, посвященных реагрегации клеток губок (Wilson, 1907, 1910;

Huxley, 1912; Galtsoff, 1925b; Wilson, Penney, 1930) описывается полное восстановление функциональных особей C. prolifera и Sycon raphanus Schmidt, 1862 из суспензий клеток, полученных механическим методом. Сформировавшиеся в результате реагрегации, округлые многоклеточные агрегаты были способны к слиянию и прикреплению к субстрату. После прикрепления в агрегатах наблюдалось образование каналов водоносной системы (они появлялись как изолированные лакуны, которые постепенно сливались друг с другом), хоаноцитных камер и элементов скелета. Завершающим этапом реорганизации агрегатов было появление оскулярного возвышения. В полученных таким образом губках наблюдали токи воды и биение жгутиков хоаноцитов.

Весь процесс восстановления губки в лаборатории занимал 6-20 суток. Похожие результаты были получены и в более современных работах во время экспериментов с E. fluviatilis (Ефремова 1968, 1969, 1972; De Sutter, Van de Vyver, 1977; Buscema et al., 1980), S. lacustris (Ефремова, 1972; Eerkes-Medrano et al., 2015), L. baicalensis (Ereskovsky et al., 2016), H. dujardinii (Волкова, Золотарева, 1981), Haliclona cf. permollis (EerkesMedrano et al., 2015), H. panicea, L. complicata и S. lingua (Короткова, 1972а). Во время развития агрегаты указанных видов проходят стадии, сходные с описанными для агрегатов C. prolifera и представителей рода Sycon. Однако скорость развития агрегатов варьирует от вида к виду.

Напротив, ряд авторов (Krasko et al., 2002; Wiens et al., 2003; Valisano et al., 2006a) указывают на ограниченные морфогенетические потенции примморфов и невозможность восстановления функциональной особи губки после диссоциации и реагрегации ее клеток. Вместе с тем, было показано, что при культивировании примморфов S. domuncula на полилизиновых или галектиновых подложках (Wiens et al., 2003; Mller et al., 2004b), экспонировании их сильному течению (20 см/сек) (Perovi et al., 2003), а также при добавлении в культуральную среду ионов железа и кремния (Le Pennec et al., 2003) у примморфов наблюдается формирование каналов водоносной системы и дермальной мембраны. Однако дальнейшего прогрессивного развития агрегатов в ходе этих экспериментов не происходило.

Различия в способности клеток разных видов губок к реагрегации и последующему восстановлению исходной структуры были наглядно продемонстрированы в исследованиях, где одновременно использовались несколько видов губок (Sipkema et al., 2003; Valisano et al., 2006a; Eerkes-Medrano et al., 2015).

Только небольшая доля исследованных видов была способна к восстановлению исходной организации губки, клетки большинства видов были способны формировать примморфы, а у части видов реагрегация останавливалась на стадии многоклеточных агрегатов. Эти результаты могут указывать как на принципиальные различия в способности клеток разных видов губок к реагрегации после диссоциации тканей (что может быть связано с особенностями строения и физиологии видов), так и просто на разные потребности в условиях, при которых должна протекать реагрегация. На верность второго предположения указывают различные результаты процесса реагрегации клеток одного и того же вида у разных исследователей: 1) Сикема с соавторами указывают, что клетки A. polypoides способны формировать примморфы (Sipkema et al., 2003), однако в экспериментах Валисано и коллег реагрегация клеток этого же вида губки доходит только до стадии многоклеточных агрегатов (Valisano et al., 2006a); 2) эксперименты Коротковой (1972) с H. panicea показали способность клеток губки восстанавливать исходную организацию губки в ходе процесса реагрегации, но Иркес-Медрано (Eerkes-Medrano et al., 2015) с коллегами указывают, что реагрегация клеток этого вида идет только до стадии многоклеточных агрегатов. В пользу второго предположения также говорят результаты экспериментов по регенерации H. panicea из небольших фрагментов тела: восстановление в полном объеме было возможно только в тщательно подобранных условиях (Короткова, Никитин, 1969а, б).

Как уже было сказано выше, на характер реагрегации клеток и возможность восстановления исходной организации может сильно влиять и физиологическое состояние тканей губки, которое заметно меняется в ходе жизненного и репродуктивного циклов, а также в разные сезоны года (Иванова, 1978; Korotkova, 1979;

Ereskovsky, 2000). Возможность восстановления исходной организации губки в ходе реагрегации клеток только на определенных стадиях репродуктивного цикла была продемонстрирована для ряда видов из класса Demospongiae (Ефремова, 1969, 1972;

Волкова, Золотарева, 1981; Короткова, 1997; Korotkova, 1979) (см. раздел 1.2.7), а различия в интенсивности реагрегации в разные сезоны года показаны для средиземноморской губки P. ficiformis (Valisano et al., 2006b). Кроме того, наблюдается корреляция между характером реагрегации клеток у данного вида губки и структурой его жизненного цикла: если в жизненном цикле губки после полового размножения присутствует этап формирования внутренних почек или редукционных телец, то обычно у такого вида в результате реагрегации клеток происходит восстановления исходной организации особи. К таким видам относятся пресноводные губки родов Ephydatia и Spongilla, а также морские представители из родов Halisarca и Halichondria (Korotkova, 1979).

Исследователи расходятся во мнении и относительно процессов, происходящих при морфогенетических преобразованиях примморфов. Разногласия касаются возможности и степени дедифференцировки клеток после их диссоциации, а также возможности трансдифференцировки и участия в формообразовательных процессах клеток различных типов. Так Гексли (Huxley, 1912), Бриан (Brien, 1937) и Брёнстед (Brnsted, 1937) рассматривают процессы развития, происходящие после диссоциации тканей, как “самосборку” и перегруппировку клеток в соответствии с их исходной дифференцировкой. При этом Гексли (Huxley, 1912) считает, что после диссоциации тканей клетки временно дедифференцируются, но их редифференцировка возможна только в исходном направлении. Согласно точке зрения упомянутых авторов для развития новой особи необходимо наличие в примморфе всех типов клеток, присутствующих в интактной губке. Другой точки зрения придерживаются Уилсон

1907) и Гальцов (Galtsoff, допускающие возможность (Wilson, 1925b), трансдифференцировки определенных типов клеток и придающие этим клеткам особое значение в морфогенезе. При этом Уилсон (Wilson, 1907) считает, что после диссоциации тканей все клетки претерпевают дедифференцировку и возвращаются к эмбриональному тотипотентному состоянию. Гальцов (Galtsoff, 1925b), напротив, отрицает возможность такой глубокой дедифференцировки клеток. Изменения клеток, происходящие после диссоциации тканей, он считает лишь неглубокими изменениями морфологии, но никак не возвращением к тотипотентному состоянию клеток.

Подробные исследования динамики реагрегации клеток губок и структуры формирующихся агрегатов позволили ответить на некоторые из этих вопросов. Было показано, что формирование и прогрессивное развитие примморфов сопровождается пролиферацией и гибелью части клеток, а также процессами дедифференцировки и трансдифференцировки некоторых типов клеток. В процессе развития примморфа жизнеспособные клетки либо сохраняют свою дифференцировку, либо в определенных случаях могут испытывать трансдифференцировку в другие типы клеток. У представителей класса Demospongiae трансдифференцировке подвергаются в основном ядрышковые амебоциты, а у представителей класса Calcarea – хоаноциты (Ефремова, 1968, 1969, 1972; Короткова, 1972а, 1997; Ефремова, Никитин, 1973; Никитин, 1973б;

Волкова, Золоторева, 1981; Ereskovsky et al., 2016).

Возможность трансдифференцировки ядрышковых амебоцитов была показана путем анализа пролиферации и числа клеток разных типов в агрегатах E. fluviatilis и Анализу подверглись 3 типа клеток: ядрышковые амебоциты, S. lacustris.

безъядрышковые амебоциты и колленциты. По мере увеличения возраста агрегатов пролиферативная активность ядрышковых амебоцитов сильно возрастала, а пролиферативная активность безъядрышковых амебоцитов и колленцитов не менялась.

В тоже время, доля ядрышковых амебоцитов в составе агрегата постепенно уменьшалась, а количество безъядрышковых амебоцитов и колленцитов увеличивалось.

Эти факты указывают на способность ядрышковых амебоцитов трансдифференцироваться в безъядрышковые амебоциты и колленциты (Ефремова, 1968, 1972). Широкие морфогенетические потенции ядрышковых амебоцитов у губок из класса Demospongiae были подтверждены в опытах с многоклеточными агрегатами E. fluviatilis, состоящими только из этого типа клеток. В этих опытах агрегаты были способны к прогрессивному развитию, в ходе которого восстанавливались все структуры дефинитивной губки (кроме оскулярной трубки, но это может быть связано с недостаточной длительностью экспериментов). Таким образом, ядрышковые амебоциты были способны давать начало всем остальным типам клеток губки (Никитин, 1973б;

De Sutter, Van de Vyver, 1977; Buscema et al., 1980).

В ходе развития агрегатов E. fluviatilis, S. lacustris и L. baicalensis была показана возможность трансдифференцировки ядрышковых амебоцитов в экзопинакоциты (это происходит, если амебоцит оказывается на поверхности многоклеточного агрегата), а хоаноцитов – в экзо- и эндопинакоциты (это происходит, если хоаноцит оказывается либо в составе слишком крупной хоаноцитной камеры (трансдифференцируется в эндопинакоцит), либо на поверхности многоклеточного агрегата (трансдифференцируется в экзопинакоцит)). Трансдифференцировка сопровождается уплощением клетки, а в случае хоаноцитов и потерей воротничка микроворсинок и жгутика (Ефремова, 1969, 1972; Волкова, Золотарева, 1981; Ereskovsky et al., 2016).

На примере развития агрегатов S. lingua и L. complicata была показана возможность трансдифференцировки хоаноцитов известковых губок в зависимости от их положения в пинакоциты или амебоциты. В ряде случаев после дедифференцировки хоаноциты возвращаются к своей исходной дифференцировке. Амебоциты в составе агрегатов этих видов также способны к трансдифференцировкам, но в меньшей степени, чем хоаноциты (Короткова, 1972а). Морфогенетические потенции хоаноцитов известковых губок, судя по всему, зависят от клеточного состава агрегатов: агрегаты Clathrina multiformis (Breitfuss, 1898), состоящие только из хоаноцитов, не развивались в полноценных губок, а хоаноциты в их составе не были способны к трансдифференцировкам (Короткова, Соколова, 1973).

Таким образом, ядрышковые амебоциты (у Demospongiae) и хоаноциты (у Calcarea) восполняются недостаток клеток других типов. Они сначала претерпевают процесс дедифференцировки, после чего способны трансдифференцироваться в экзо- и эндопинакоциты, хоаноциты, склероциты и колленциты. В тоже время ряд типов клеток представителей класса Demospongiae оказываются неспособен к дедифференцировкам и трансдифференцировкам. Эти клетки сохраняют свою исходную специализацию. К таким типам клеток относятся эндопинакоциты и амебоциты со специфическими включениями (Ефремова, 1968, 1969, 1972; Ефремова, Никитин, 1973; Никитин, 1973б;

Волкова, Золоторева, 1981; Короткова, 1997; Ereskovsky et al., 2016).

В определении судьбы клеток, подвергшихся трансдифференцировке, большую роль играет место, которое они занимают в примморфе. Группы хоанобластов возникают всегда в центральной части примморфа, а пинакоциты – преимущественно на поверхности или вблизи нее. Вероятно, в примморфе возникает определенный физиологический градиент, связанный с формированием различий микросреды в центре и на периферии агрегата, которые и определяют направление трансдифференцировки клеток (Никитин, 1973б; Волкова, Золоторева, 1981). Подтверждением этого предположения служит неспособность к прогрессивному развитию агрегатов малых размеров. Бриен и Мюллер, изучавшие процесс реагрегации клеток у E. fluviatilis, отмечали, что для прогрессивного развития агрегат должен состоять примерно из 1000 клеток (Mller, 1911; Brien, 1937). По данным Коротковой многоклеточные агрегаты S. lingua размерами 10-100 мкм в большинстве случаев не способны к прогрессивному развитию и гибнут в течение второй недели культивирования (Короткова, 1972а).

Гальцову и Багби удалось показать, что к прогрессивному развития у C. prolifera способны лишь агрегаты размерами больше 200-250 мкм (состоят из более, чем 2000 клеток) (Galtsoff, 1925b; Bagby, 1972). Подробное изучение морфогенетических потенций многоклеточных агрегатов E. fluviatilis в зависимости от их размера показало, что к прогрессивному развитию способны лишь агрегаты, имеющие размеры более 200 мкм. Более мелкие агрегаты (50-150 мкм) либо вообще не способны к прогрессивному развитию, либо их морфогенетические потенции сильно ограничены. В некоторых случаях у таких агрегатов может происходить эпителизация поверхности, образование мелких хоаноцитных камер из участков хоаноцитного эпителия материнской губки (но никогда путем трансдифференцировки амебоцитов), а также формирование отдельных каналов водоносной системы, но с заметным отставанием от более крупных агрегатов.

Однако мелкие агрегаты никогда не прикрепляются к субстрату и не восстанавливают полноценную водоносную систему. Сходные явления наблюдаются в разноразмерных агрегатах E. fluviatilis, состоящих только из ядрышковых амебоцитов: к прогрессивному развитию были способны лишь агрегаты больше 250 мкм в диаметре. Эти факты можно объяснить недостаточным различием микросреды в центре и на периферии агрегатов изза его небольших размеров, что препятствует полноценной дифференцировке клеток и развитию функциональных губок (Ефремова, Никитин, 1973; Никитин, 1973б;

Короткова, 1997; Korotkova, 1979).

В целом, формирование новой губки при прогрессивном развитии агрегатов включает в себя следующие этапы: 1) реагрегация клеток и формирование устойчивых агрегатов (ранних примморфов) определенного размера; 2) эпителизация поверхности ранних примморфов (преобразование в настоящие примморфы); 3) прикрепление к субстрату; 4) приобретение дефинитивной организации (формирование водоносной системы, скелета и т.д.) (Ефремова, 1969; Короткова, 1972а, 1997; Волкова, Золоторева, 1981; Korotkova, 1979; Eerkes-Medrano et al., 2015; Ereskovsky et al., 2016).

Для большинства видов губок прикрепление примморфов к субстрату является ключевым моментом развития (Galtsoff, 1925b; Волкова, Золотарева, 1981). Именно в этот момент происходит изменение полиаксиальной симметрии на апикобазальную.

Прикрепление к субстрату сопровождается значительными изменениями в распределении различных типов клеток внутри примморфа. Если отделить развивающийся примморф от субстрата, в его организации начинаются регрессивные изменения (Ефремова, 1969; Короткова, 1972а; Ефремова, Никитин, 1973б; Galtsoff, 1925b). Вместе с тем, для H. dujardinii, в отличие от других видов губок, прикрепление к субстрату не является решающим моментом развития. Примморфы этого вида способны развиваться во взвешенном состоянии. Однако отсутствие контакта с субстратом влияет на завершающий этап развития – формирование оскулюма. У неприкрепленных примморфов формируется не одно, а несколько оскулярных отверстий (Волкова, Золоторева, 1981).

Приведенные выше факты однозначно говорят в пользу возможности восстановления исходной организации губки в процессе реагрегации ее клеток. С большой долей вероятности можно утверждать, что во время реагрегации клеток и при последующем формировании губки основное значение играют процессы, связанные с дедифференцировкой и трансдифференцировкой клеток, а также с различным поведением клеток в зависимости от их положения в примморфе. Это позволяет полностью отказаться от представлений о процессах, происходящих после диссоциации тканей губок, как о “самосборке” исходно дифференцированных клеток.

1.2.9. Заключение: реагрегация клеток как модель для изучения особенностей функционирования тканей губок В меняющихся гидродинамических условиях окружающей среды губкам для осуществления эффективной фильтрации воды через всю поверхность и объем тела необходимо постоянно перестраивать свою водоносную систему. В связи с этим ткани, клеточные линии и организация водоносной системы этих животных крайне пластичны (Ересковский, 2005). В тоже время, несмотря на постоянное перемещение клеток и ремоделирование анатомических структур, губка является единым интегрированным организмом. В своей организации эти животные смогли найти баланс между очень высокой пластичностью всех структур в теле и интеграцией этих структур в единую систему. Это требует наличия механизмов межклеточной интеграции и коммуникации, значительно отличающихся от таковых у других Metazoa. Реагрегация клеток губок представляет собой удобную модельную систему, которая позволяет в контролируемых условиях исследовать различные аспекты функционирования тканей у губок.

Реагрегация клеток губок включает в себя несколько стадий: 1) адгезия клеток и формирование стабильных многоклеточных агрегатов, 2) эпителизация многоклеточных агрегатов (формирование примморфов) и, в некоторых случаях, 3) развитие примморфов в полностью функциональную губку. Различные этапы этого процесса позволяют изучать механизмы клеточной адгезии и иммунного распознавания, поведение и взаимодействие клеток разных типов, а также проследить восстановление исходных связей между клетками и формирование основных структурных элементов организма.

Реагрегация клеток губок происходит благодаря высокомолекулярному комплексу – фактору агрегации. Судя по накопленным данным, этот же комплекс принимает участие в обеспечении видовой и, вероятно, индивидуальной специфичности клеток и тканей губок. При этом многие детали протекания иммунного распознавания у губок, а также молекулярные механизмы, его обеспечивающие, до конца не изучены (Fernndez-Busquets et al., 2002). Совмещение у губок механизмов клеточной адгезии и иммунного распознавания позволяют использовать ранние этапы процесса реагрегации для изучения механизмов иммунного распознавания на уровне отдельных клеток или клеточных линий. Из-за относительно простой организации губок и отсутствия у них органов можно предположить, что и иммунная система этих животных устроена относительно просто. Исследование иммунной системы у самых примитивных Metazoa может помочь лучше понять устройство и детали функционирования иммунной системы у высокоорганизованных животных, в том числе и человека.

Интенсивность процесса реагрегации клеток значительно варьирует у разных видов губок, потому только изучение этого процесса у широкого спектра видов, который охватывает все крупные таксономические группы губок, позволит понять морфогенетические потенции и взаимоотношения клеточных линий у этих древних животных.

Особый интерес представляет стадия примморфов. После окончательного формирования данных агрегатов у ряда видов губок наблюдается восстановление исходной организации животного. Этот процесс является результатом не простой “самосборки” и сортировки дифференцированных клеток. В ходе описанных восстановительных морфогенезов имеют место активные дедифференцировки и трансдифференцировки определенных клеточных типов. Дальнейшая судьба клеток, судя по всему, определяется их положением в агрегате. В процессе развития примморфов происходит формирование новой системы координат, регулирующей дальнейшие процессы восстановления организации губки. Таким образом, формирование примморфов и восстановление из них полноценных губок позволяют изучать процессы становления и регуляции пространственной организации многоклеточных организмов в их онтогенезе.

Самостоятельный интерес представляют вопросы, касающиеся процессов, определяющих и регулирующих возможность восстановления интактной организации губки из примморфов. Детальное изучение поведения клеток во время преобразования примморфов в полноценную губку позволит понять механизмы, которые обеспечивают интеграцию тканей губок и высокую пластичность клеточных и анатомических структур в их теле. Кроме того, морфогенезы, происходящие при прогрессивном развитии многоклеточных агрегатов и последующем восстановлении исходной организации губки, крайне сходны с морфогенезами, имеющими место при развитии новых особей из редукционных телец или в ходе бесполого размножения (Ересковский, 2005;

Bergquist, 1978; Ereskovsky, 2011). Культуры многоклеточных агрегатов, как модельная система, в определенной степени облегчают изучение этих процессов, так как позволяют проводить исследования в контролируемых условиях, что затруднительно при работе с интактными губками.

Потенциально возможные долговременные стабильные культуры примморфов позволят также изучать биохимию и физиологию различных клеток, процессы спикулогенеза. Кроме того, долговременные культуры примморфов могут стать основой для получения биологически активных веществ губок для фармацевтической и косметической промышленности (Fernndez-Busquets et al., 2002; Pomponi, 2006). Тем не менее, для этого требуется серьезная доработка методов, связанная, в первую очередь, с подбором состава культуральной среды и условий культивации примморфов. Это необходимо для увеличения продолжительности жизни примморфов, а также для стимуляции в них митотических делений, которые обеспечат увеличение биомассы в культурах.

–  –  –

В качестве объектов исследования были использованы три вида губок из кл. Demospongiae (Halichondria panicea (Pallas, 1766), Haliclona aquaeductus (Schmidt, 1862), Halisarca dujardinii Johnston, 1842) и один вид из кл. Calcarea (Leucosolonia complicata (Montagu, 1814)). Сбор образцов проводили в Кандалакшском заливе Белого моря в окрестностях Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (66°34 N, 33°08 E). Образцы H. panicea и H. aquaeductus собирали легководолазным методом с глубин 10-15 м.

Образцы H. dujardinii и L. complicata собирали в верхней сублиторали с глубин 0-2 м во время отлива. До начала экспериментов губок содержали в аквариумах с проточной морской водой при температуре 6-10°C не более 24 часов.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
Похожие работы:

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" РАБОЧАЯ ПРОГРАММА дисциплины...»

«***** ИЗВЕСТИЯ ***** № 4 (44), 2016 Н И Ж Н Е В О ЛЖ С КОГ О А Г Р ОУ Н И В Е РС И Т ЕТ С КОГ О КО МП Л Е КС А : Н А У КА И В Ы С Ш Е Е П Р О ФЕ СС И О Н А Л Ь Н О Е О Б Р А З О В А Н ИЕ УДК 636.033 ИНТЕНСИВНОСТЬ РОСТА И МЯСНАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ БЫЧКОВ РАЙОНИРОВАННЫХ ПОРОД...»

«Научно-исследовательская работа Интеллект как способность адаптироваться к окружающей среде Выполнил: Темнов Артем Евгеньевич, учащийся 11 класса Муниципального бюджетного обще...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Кемеровский государственный университет Биологический факультет ПРОГРАММА ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ (ПРОФИЛЬНОЙ) ПРАКТИКИ Направление подготовки 06.03.01 Биология Направленность (профиль) подготовки Генетика Уровень...»

«Муниципальное бюджетное образовательное учреждение дополнительного образования станция юных натуралистов г. Холмска муниципального образования "Холмский городской округ" Сахалинской области Рассмотрена УТВЕРЖДЕНА на педагогическом сов...»

«1. Цель освоения дисциплины Целью освоения дисциплины "Экология животных" является формирование у студентов навыков в описании животных определенной экосистемы в их взаимосвязи с внешней средой и другими живыми организмами и в применении полученных знаний для решения зада...»

«КОЛПАКОВ Федор Анатольевич ФОРМАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ И ВИЗУАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ 03.01.09 Математическая биология, биоинформатика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена...»

«Министерство образования Республики Беларусь Министерство природных ресурсов и охраны окружающей среды Комитет по проблемам последствий катастрофы на чернобыльской АЭС при Совете Министров Республики Беларусь Постоянная комиссия по радиоэкологическому образованию стран СНГ Национальная ака...»

«Вестник МГТУ, том 9, №5, 2006 г. стр.747-756 Зональная тундра на Кольском полуострове – реальность или ошибка? Н.Е. Королева Полярно-альпийский ботанический сад-институт КНЦ РАН, Апатитский филиал МГТУ, кафедра геоэкологии Аннотация....»

«Ержанов Н.Т. Инвентаризация флоры и фауны различных районов Центрального Казахстана и оценка их современного состояния / Н.Т.Ержанов, Х.А.Исенов, Г.Т.Картбаева // Актуальные проблемы экологии = Экологияны зекті мселелері: Материалы междунар. науч.-практ. конф....»

«Б.2Б.6 Экология Лекции Экология как биологическая наука. Контрольна 2 1, 3, 4, 5, Использование термина "экология" в я№1 6-8 современной жизни человека. Краткая история развития экологии. Разделы экологии. Структура современной экологии. Основные направления и...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ПРОГРАММА-МИНИМУМ кандидатского экзамена по специальности 25.00.36 "Геоэкология" (в горнорудной промышленности) по техническим и химическим...»

«БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙРОТОКСИНОВ ТРОПИЧЕСКОЙ АКТИНИИ HETERACTIS CRISPA Кветкина Александра Николаевна студент, Дальневосточный федеральный университет, РФ, г. Владивосток E-mail: sashaledy.ru@mail.ru Калина Римма Сергеевна студент, Дальневосточ...»

«Экология языка и коммуникативная практика. 2014. № 1. С. 45–56 Концептуализация и коммуникативная реализация категории субъекта деятельности в повседневном речевом общении русских А.В. Колмогорова УДК 81...»

«Вестник науки Сибири. 2012. № 4 (5) http://sjs.tpu.ru УДК 338.3:658.18 ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ СОСТАВЛЯЮЩАЯ ЭКОНОМИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ РОССИИ Желбунова Любовь Ивановна, старший преподаваЛ.И. Желбунова тель кафедры экономики ТПУ. Томский политехнический уни...»

«УДК 339 (075) ББК 65 247 Фонд оценочных средств по дисциплине "Биология" для направления подготовки 38.02.04 "Коммерция (по отраслям)" под общей редакцией Шаихова А.А. – Махачкала: Типография ДГИНХ, 2014.-29с. Фонд оценочных средств по дисциплине "Биология" включает все...»

«1. Цель освоения дисциплины Целью освоения дисциплины "Агроэкология" является формирование навыков рационального использования потенциальных возможностей почвы, растений и животных при производстве сельскохозяйственной продукции.2. Место дисциплины в струк...»

«Э. Говасмарк, А. Гронлунд Норвежский институт сельскохозяйственных и экологических исследований Анаэробно обработанные отходы могут быть использованы непосредственно как удобрение для зерновых культур, а также могут заменить минеральные...»

«ПСИХОЛОГИЯ А.Ф.Корниенко ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ОРГАНИЗМА И ЗАЧАТОЧНАЯ ФОРМА ПСИХИКИ На начальных этапах эволюции живые организмы приобретают способность избирательно реагировать на жизненно важные (биотические) воздействия внешней среды. Механизм, позволяющий организму выделять из множества воздействий те, которые имеют для него био...»

«Бюллетень Брянского отделения РБО, 2016. Bulletin of Bryansk dpt. of RBS, 2016. № 1(7). С. 68–75. N 1(7). P. 68–75. ЮБИЛЕИ И ДАТЫ К 85-ЛЕТИЮ КАФЕДРЫ БОТАНИКИ-БИОЛОГИИ БРЯНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА ИМЕНИ АКАДЕМИКА...»

«ИГНАТОВА Валентина Александровна ИНТЕГРИРОВАННЫЕ УЧЕБНЫЕ КУРСЫ КАК СРЕДСТВО ФОРМИРОВАНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ УЧАЩИХСЯ 13. 00. 01 — общая педагогика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора педагогических наук Тюмень Работа выполнена на кафедре общей и социальной педагоги­ ки Тюменского государственного университета Н...»

«1 1. Цель освоения дисциплины Целью освоения дисциплины "Экология" является формирование у студентов навыков проведения экологической оценки состояния земельных ресурсов, прогнозирования изменений земель под влиянием антропогенного фактора и разработки рекомендаций по их восстановлению.2. Место дисциплины в структуре О...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" АННОТАЦИЯ РАБОЧЕЙ ПРОГРАММЫ по дисциплине Экологические пр...»

«Научно-исследовательская работа Тема работы ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ НАПИТКИ. ВЛИЯНИЕ НА ОРГАНИЗМ. Выполнила: Вишнякова Наталья Владимировна учащаяся _11 класса МБОУ СШ № 84 г. Красноярск Научный руководитель: Киселева Галина Григорьевна учитель биоло...»

«1 Городская научно-практическая конференция молодых исследователей научно-социальной программы "Шаг в будущее" Создание костюма Матери-Земли и декорации к проведению экологического фестиваля "Наш дом – планета Земля"Авт...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.