WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 


«Роль локуса flamenco и генов hp1 в регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy у Drosophila melanogaster ...»

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

На правах рукописи

ЛАВРЕНОВ АНТОН РУСЛАНОВИЧ

Роль локуса flamenco и генов hp1 в регуляции транспозиции

ретротранспозонов группы gypsy

у Drosophila melanogaster

03.02.07 – генетика

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологический наук, профессор Ким А.И.

Москва – 2014 Оглавление Список сокращений

I.МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ И МЕХАНИЗМЫ

КОНТРОЛЯ ИХ ТРАНСПОЗИЦИИ (обзор литературы)

I.1.Классификация МГЭ.

I.2.Структура и механизм транспозиции ДКП ретротранспозонов............... 13 I.3.Механизмы регуляции транспозиции ретроэлементов.

I.3.1.РНК-интерференция

I.3.1.1.Пути РНК-интерференции, связанные с siРНК и miРНК

I.3.1.2.Путь РНК-интерференции, связанный с piРНК

I.3.2.Регуляция посредством участия белков семейства HP1

II.МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

II.1.Материалы

II.1.1.Линии D. melanogaster и их характеристики

II.1.2.Штаммы Escherichia coli

II.1.3.Векторы

II.2.Методы

II.2.1.Приготовление компетентных клеток E. coli

II.2.2.Трансформация E. сoli

II.2.3.Выделение хромосомной ДНК

II.2.4.Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli

II.2.5.Сбор тканей для последующего выделения РНК

II.2.6.Выделение тотальной РНК

II.2.7.Обработка ДНКазой

II.2.8.Обратная транскрипция

II.2.9.Полимеразная цепная реакция

II.2.10.Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени............. 46 II.2.11.Клонирование в плазмидах и получение векторных конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов

II.2.12.Электрофорез в агарозном геле

II.2.13.Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля

II.2.14.Секвенирование

II.2.15.Получение рекомбинантных белков

II.2.16.Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии MOPS

II.2.17.Окраска полиакриламидных гелей красителем Coomassie G-250..... 49 II.2.18.Диализ растворов белков

II.2.19. Измерение концентрации белка

II.2.20. Анализ ДКН-связывающей активности рекомбинантного белка НР1а

III.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III.1.Анализ транскрипции локуса flamenco

III.2.Молекулярно-генетический анализ сплайсинга локуса flamenco.......... 52 III.3.Анализ экспрессии генов системы РНК-интерференции

III.4.Анализ роли белков семейства HP1 в регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy

III.4.1.Анализ экспрессии генов семейства hp1

III.4.2.

Связывание белка HP1a с нетранслируемыми областями ретротранспозонов группы gypsy

III.4.2.1Получение рекомбинантного белка HP1a.

III.4.2.2. Получение генетических конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов группы gypsy

III.4.2.3Гель-шифт анализ

Заключение

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение 1

Список сокращений ДКП – длинные концевые повторы мобильного генетического элемента МГЭ – мобильный генетический элемент миРНК (miРНК) – микроРНК ОРС – открытая рамка считывания п.н. – пары нуклеотидов ПЦР – полимеразная цепная реакция т.

п.н. – тысяча пар нуклеотидов dNTPs – дезоксинуклеозид-трифосфат EDTA – ЭДТА – этилендиаминтетраацетат piРНК - РНК, взаимодействующие с белком Piwi pri-miРНК - первичная (primary) миРНК SDS – додецилсульфат натрия MOPS - 3-[N-Морфолино]пропансульфоновая кислота siРНК - малые интерферирующие РНК SS – стабильная линия TAE – трис-ацетатный буфер Tris – Трис – гидроксиметиленаминометан UTR – untranslated region – нетранслируемая область гена

–  –  –

Мобильные генетические элементы (МГЭ) имеют широкое распространение в геномах про- и эукариот и составляют значительную часть геномной ДНК многих изученных организмов. У эукариот выделяют 4 основных класса мобильных элементов: ДНК-транспозоны, LINE (длинные рассеянные ядерные элементы) и SINE (короткие рассеянные ядерные элементы), а также ДКП-ретротранспозоны (ретротранспозоны с длинными концевыми повторами) и эндогенные ретровирусы.

МГЭ могут существенно влиять на генетический материал хозяина.

Перемещаясь внутри генома, они могут вызывать различные мутации [McClintock, 1953]. Таким образом, МГЭ играют важную роль в формировании генетической изменчивости. Некоторые МГЭ, такие как HET-A и TART стали незаменимыми в поддержание теломер у дрозофилы.

SINE и LINE элементы участвуют в процессах репарации двунитевых разрывов ДНК у дрожжей [Kidwell, Lisch, 1997].

Особый интерес для исследования представляют ДКПретротранспозоны с тремя открытыми рамками считывания (ОРС). По своей структуре они схожи с ретровирусами. Кодирующая часть ДКПретротранспозонов содержит OPC, гомологичные ретровирусным генам gag, pol и env, поэтому их принято считать группой эндогенных ретровирусов. У Drosophila melanogaster данная группа представлена группой gypsy.

Высокая транспозиционная активность МГЭ опасна для организма, так как повышает частоту возникновения мутаций. По этой причине в геноме существуют механизмы, подавляющие транспозиции МГЭ.

Подавление экспрессии МГЭ у может D. melanogaster осуществляться как путем РНК-интерференции, так и путем непосредственной компактизации участков хромосом, содержащих МГЭ при активном участии белков семейства HP1 (heterochromatin protein 1).

Известно, что эти два пути тесно связаны между собой: РНКинтерференция играет важную роль в формировании гетерохроматина и, по-видимому, направляет его формирование [Lippman, Martienssen, 2004].

Мутации в генах, задействованных в механизме РНК-интерференции, приводят к снижению уровня гистона H3, метилированного по лизину в 9м положении (H3К9), и к неправильной локализации гетерохроматиновых белков семейства HP1 на хромосомах [Moshkovich, Lei, 2010]. В свою очередь, белки семейства HP1 принимают активное участие в регуляции экспрессии кластеров малых РНК, необходимых для процесса РНКинтерференции [Klattenhoff, 2009; Basquin, 2014].

Линия SS [Ким и др., 1986; 1989] имеет мутантный фенотип flamenco, который характеризуется повышенной частой транспозиции МГЭ группы gypsy. Фенотип flamenco может быть обусловлен разными причинами. В генотипе линии SS может присутствовать мутация в локусе flamenco. Установлено, что flamenco контролирует транспозицию элемента gypsy. Локус flamenco локализован в перицентромерном районе Xхромосомы и представляет собой кластер-матрицу для считывания предшественника малых РНК, ассоциированных с белком PIWI (piРНК).

Не исключено, что в генотипе линии SS имеются мутации в генах, задействованных в процессинге первичных транскриптов подобных кластеров. Также возможны нарушения со стороны генов семейства hp1.

Цели и задачи исследования Целью работы было исследование механизмов регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy у Drosophila melanogaster.

Были поставлены следующие задачи:

–  –  –

Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для исследования вопросов, связанных с механизмами контроля ретроэлементов и ретровирусов в геноме эукариот.

Апробация результатов.

Работа прошла апробацию на VII, VIII и IX конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2011, 2012, 2013), XX и XXI международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» и «Ломоносов-2014» (Москва) и семинарах лаборатории генетики животных Биологического факультета МГУ им. М.В.

Ломоносова.

Личное участие автора. Основная часть работы выполнена непосредственно автором. Эксперименты по измерению уровней экспрессии локуса flamenco и генов семейства hp1 выполнялись совместно с аспирантом Потаповой М.В. и студентом магистратуры Шмельковой А.О.

соответственно. Поставленные задачи решены с применением современных методов генетики. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 101 страницах, содержит 23 рисунка, 2 таблицы, 1 приложение и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 128 цитируемых источника.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК – 2, тезисов докладов и материалов конференций – 7.

I. МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ И МЕХАНИЗМЫ

КОНТРОЛЯ ИХ ТРАНСПОЗИЦИИ (обзор литературы)

–  –  –

Мобильные генетические элементы представляют собой последовательности ДНК, способные перемещаться внутри генома.

МГЭ имеют широкое распространение и составляют большую часть геномной ДНК многих изученных организмов. У эукариот выделяют 4 основных класса мобильных элементов: ДНК-транспозоны и ретроэлементы, такие как LINE (Длинные рассеянные ядерные элементы), SINE (короткие рассеянные ядерные элементы) и ДКП-ретротранспозоны.

–  –  –

ДКПретротранспозоны Рис.1. Классификация мобильных генетических элементов.

У большинства ДНК-транспозоны распространены в меньшей степени, чем ретроэлементы. В отличие от других классов МГЭ, транспозиция данных элементов осуществляется исключительно путем вырезания и последующего встраивания элемента. Автономные ДНКтранспозоны содержат ген, кодирующий фермент транспозазу.

Транспозаза узнает короткие инвертированные повторы, имеющиеся на концах МГЭ, и осуществляет вырезание. При этом транспозаза может способствовать транспозиции неавтономных элементов, не содержащих в своей последовательности гена транспозазы. Увеличение копий ДНКтранспозонов происходит благодаря процессам рекомбинации и репликации.

Ретроэлементы осуществляют перемещение через РНК-посредник.

Обратная транскриптаза, кодируемая элементами, синтезирует комплементарную ДНК (кДНК) на основе РНК ретротранспозона, а затем встраивает полученную копию в геном. Такой способ интеграции называют ретротранспозицией.

LINE-элементы имеют две открытые рамки считывания (ОРС1 и ОРС2). ОРС1 кодирует РНК-связывающий белок, а ОРС2 — нуклеазу и обратную транскриптазу. Транскрипция LINE инициируется с 5' промотора РНК-полимеразы II и терминируется поли-А хвостом на 3'-конце.

SINE элементы намного короче LINE из-за отсутствия генов, кодирующих собственные ферменты. Хотя у SINE элементов имеются и промоторная область, и поли-А конец, для транспозиции SINE заимствуют обратные транскриптазы у LINE.

–  –  –

ретровирусным генам gag, pol и env, поэтому их принято считать группой эндогенных ретровирусов.

МГЭ могут существенно влиять на генетический материал хозяина.

Перемещаясь внутри генома, они могут вызывать различные мутации [McClintock, 1953]. Таким образом, МГЭ играют важную роль в формировании генетической изменчивости. Некоторые МГЭ, такие как HET-A и TART стали незаменимыми в поддержание теломер у дрозофилы.

SINE и LINE элементы участвуют в процессах репарации двунитевых разрывов ДНК у дрожжей [Kidwell, Lisch,1997].

I.2. Структура и механизм транспозиции ДКП ретротранспозонов

Как упоминалось выше, ДКП-ретротранспозоны имеют схожее с ретровирусами строение и механизм репликации. С обоих концов они окружены длинными концевыми повторами (ДКП). В структуре ДКП разделяют три основные области U3, R и U5. Эти области играют важную роль при обратной транскрипции. В U3 (Unique 3’ region) участке расположены элементы энхансера и промотора. В конце участка U3 и начале области R имеется TATA-бокс.

ТАТА-бокс служит промотором для транскрипции РНК-полимеразой II. В нетранслируемых областях элементов содержатся последовательности энхансеров, предположительно регулирующие количество производимой транскрипции. Транскрипция идет через всю длину ретроэлемента до поли-А конца 3'LTR. Полученный транскрипт выступает матрицей для обратной транскрипции. Затравкой для обратной полимеразы служит тРНК, отжигающаяся в пределах5'LTR. Далее происходит синтез ДНК копии с последующим вытеснением затравки, а затем частично деградирует матричная РНК. Оставшаяся матричная РНК служит затравкой для синтеза второй ДНК-цепи (рис.2).

Рис.2. Схема репликации МГЭ. Объяснения в тексте.

Кодирующая часть ДКП-ретротранспозонов может содержать одну, две или три OPC, гомологичные ретровирусным генам gag, pol и env.

–  –  –

Ген gag схож по структуре продукта с ретровирусным белком GAG, но не содержит консервативный РНК-связывающий мотив Cys-X2-His-X4Cys, встречающийся у других ретроэлементов. Основной его функцией является формирование белково-нуклеиновых комплексов, которые сходны с вирусными частицами ретровирусов.

–  –  –

Область гена pol способна кодировать белок, сходный по структуре с кислыми протеазами, такими как пепсин. Известно, что протеазы необходимы для транспозиции, однако механизм их действия изучен мало.

Фермент осуществляет протеолиз полипротеинового предшественника, кодируемого ретротранспозоном. В результате протеолиза образуются более мелкие белковые продукты, соответствующие доменам протеазы, обратной транскриптазы, рибонуклеазы Н, интегразы [Hansen et al., 1992].

Обратная транскриптаза.

Аминокислотная последовательность обратной транскриптазы схожа с последовательностями ретровирусов и других ретроэлементов.

Активность обратной транскриптазы влияет на транспозиционную активность элементов.

Рибонуклеаза H.

Домен рибонуклеазы Н расположен непосредственно вблизи домена обратной транскриптазы. У ретровирусов рибонуклеаза Н и обратная транскриптаза функционируют в составе одного белка. Скорее всего, ретроэлементы в этом отношении также сходны с ретровирусами.

–  –  –

Интеграза – фермент, осуществляющий встраивание обратного транскрипта в геном хозяина.

Механизм интеграции имеет три отличительные особенности:

–  –  –

Продуктами гена env являются компоненты, необходимые для взаимодействия вирусной частицы с рецепторами на мембране клетки.

Первоначально было высказано предположение, что МГЭ gypsy является ретровирусом дрозофил, вскоре это было подтверждено экспериментами in vivo [Kim et al., 1994].

У Drosophila melanogaster выделяют три группы ретротранспозонов gypsy, copia и BEL (рис.3).

Группа gypsy представлена транспозонами с одной, двумя или тремя ОРС, в то время как copia и BEL имеют лишь одну ОРС. Ретротранспозоны copia имеют консервативный домен в полипептиде, кодируемом pol ОРС.

Группа BEL также имеет высококонсервативные домены пептидазы_A17.

–  –  –

В состав группы gypsy входят три подгруппы:

1) Элементы с одной ОРС, кодирующей gag-pol белковый предшественник, а также сплайсированная РНК, кодирующая только gagбелок [Brierley et al., 1990]. К этой подгруппе относятся micropia, blastopia, mdg и Invader.

2) Элементы 412, Blood, mdg1, Stalker, Tabor., которые содержат две слегка перекрывающиеся ОРС, кодирующие gag и pol-продукты.

3) Элементы gypsy, ZAM, Idefix, Tirant, Quasimodo, nomad (opus), 17.6, 297, rover (pregun), springer, gtwin, которые подобно ретровирусам способны образовывать нуклеопротеидные вирусоподобные или настоящие вирусные частицы, благодаря третьей OPC, кодирующей envподобный белок [Shiba et al., 1983, Syomin et al., 1993]. В эту подгруппу также входят элементы McClintock, qbert, HMS-Beagle и Burdock с двумя ОРС, являющиеся предшественниками или производными ретротранспозонов rover, ZAM, nomad и gypsy с тремя ОРС соответственно [Нефедова, 2009]. Transpac входит в данную подгруппу, так как имеет сходство не с отдельными элементами, но со всей подгруппой в целом.

Высокая транспозиционная активность МГЭ опасна для организма, так как повышает частоту возникновения мутаций. По этой причине в геноме существуют механизмы, подавляющие транспозиции МГЭ I.3. Механизмы регуляции транспозиции ретроэлементов Подавление экспрессии мобильных генетических элементов (МГЭ) у может осуществляться как путем РНКDrosophila melanogaster интерференции, так и путем непосредственной компактизации участков хромосом, содержащих МГЭ.

–  –  –

РНК-интерференция – механизм подавления экспрессии генов на посттранскрипционном уровне, вызванный появлением в клетке гомологичной двухцепочечной РНК (дцРНК).

Существует три основных пути РНК сайленсинга с участием трех различных популяций малых РНК-siРНК, микроРНК и piРНК.

I.3.1.1. Пути РНК-интерференции, связанные с siРНК и miРНК Триггером механизма РНК-интерференции является дцРНК, которая может быть введена в клетку извне, образоваться в результате двунаправленной транскрипции гена, а в случае некоторых вирусов, появиться на определенных этапах их жизненного цикла.

РНКаза III Dicer процессирует дцРНК на siРНК и miРНК. Чтобы отщепить siРНК из дцРНК Dicer 2 необходимо узнать два 3'-выступающих нуклеотида и фосфат на 5'-конце у дцРНК. Отщепившаяся siРНК связывается с белком Ago 2, а затем включается в состав РНК-белкового комплекса siRISC, чтобы связаться с комплементарной мРНК. После связывания происходит разрезание и деградация мРНК. siРНК представляет собой двуцепочечную РНК длиной 20-23 нуклеотида с выступающими 3'-концами. На каждой нуклеотидной цепи имеется фосфатная группа на 5'-конце и гидроксильная – на 3'-конце. Субстратом для получения siРНК являются двуцепочечные РНК или РНК, содержащие шпильки (рис.4).

Другой класс малых РНК, miРНК, образуется в результате процессинга шпилечных структур РНК (pre-miРНК), кодируемых хозяйским геномом. Известно, что miРНК играют важную роль в процессах роста и развития [Abrahante et al., 2003; Brennecke et al., 2003;

Lee et al., 1993; Lin et al., 2003; Llave et al., 2002; Palatnik et al., 2003;

Reinhart et al., 2000]. Гены miРНК транскрибируясь образуют транскрипт, называемый pri-miРНК (primary micro РНК). Стандартная pri-miРНК состоит из шпильки, имеющей дуплекс длиной порядка 33 нуклеотидов, концевую петлю и фланкирующие ее одноцепочечные участки. Комплекс Drosha/Pasha, состоящий из

Рис.4 Путь РНК-интерференции, связанный с siРНК. Объяснения втексте

РНКазы III и белка, связывающего двуцепочечную РНК, осуществляет вырезание из pri-miРНК 70-нуклеотидного шпилечного участка – premiРНК, имеющего фосфатную группу на 5'-конце и двухнуклеотидный выступ на 3'-конце. Субстратом комплекса Drosha/Pasha является шпилька с петлей, состоящей не менее чем из 10 нуклеотидов. Вырезанная premiРНК переносится с помощью экспортина-5-ranGTP в цитоплазму. В цитоплазме с pre-miРНК связывается белок Dicer и вырезает 22нуклеотидную miРНК, которая включается в комплекс miRISC. miРНК с составе RISC-комплекса способна узнавать не полностью гомологичные мРНК-мишени, не вызывая при этом их разрезания, а останавливая процесс трансляции [Humphreys et al., 2005] (рис.5).

Рис.5 Путь РНК-интерференции, связанный с miРНК. Объяснения в тексте.

Данные пути РНК-интерференции могут пересекаться (Lee, 2004).

Дрозофила имеет два гена семейства Dicer – dicer-1 (dcr-1) и dicer-2 (dcr-2). Большинство ортологов Dicer содержат DExH-подобный АТФзависимый РНК-хеликазный домен и PAZ-домен, который так же можно найти в компонентах RISC.

–  –  –

Несмотря на специфичность Dcr-1 и Dcr-2, оба этих белка участвуют в siРНК-направленном подавлении активности генов. В обоих случаях требование не является абсолютным, белки взаимозаменяемы. Dcr-1 и Dcrтребуются для включения siРНК в siRISC, но играют разные роли. Dcr-2 требуется для формирования устойчивого комплекса siRNA-белка, который содержит Dcr-2 и R2D2 [Liu et al., 2003; Pham et al., 2004]. Этот комплекс начинает собирание siRISC. Dcr-1 не является необходимым для формирования устойчивого комплекса инициатора, зато принимает участие в формировании устойчивого промежуточного звена, необходимого для сборки комплекса siRISC. Dcr-1 в пределах комплекса инициатора облегчает устойчивую ассоциацию других факторов и формирование промежуточного комплекса.

Dcr-1, но не Dcr-2, требуется для подавления активности гена с помощью miRNAs. Потеря функционального гена dicer-2 не сильно отражается на развитии дрозофилы. Вероятно потому, что Dcr-1 обладает слабой процессирующей дцРНК активностью, что восполняет потерю DcrDcr-1 способен включать miРНК в комплекс RISC с расщепляющей активностью, а также может включать siРНК в RISC, блокирующий трансляцию.

I.3.1.2. Путь РНК-интерференции, связанный с piРНК Сайленсинг транспозонов на этапах зародышевого развития осуществляется Piwi interacting РНК (piРНК) [Malone and Hannon, 2009].

piРНК имеют длину 25-29 нуклеотидов, на 5`-конце имеют фосфатную группу и, как правило, остаток уридина [Saito et al. 2006; Vagin et al. 2006; Brennecke et al. 2007], а на 3`-конце несут 2`-O-метил, который образуется с помощью РНК-метилтрансферазы семейства Hen-1 [Horwich et al., 2007]. Впервые они были обнаружены при изучении локуса Stellate, состоящего из повторяющихся копий гена, кодирующего гомолог киназы казеина II [Livak, 1990]. Последовательности piРНК соответствуют областям генома, сильно обогащенным мобильными элементами и другими повторяющимися последовательностями [Aravin et al., 2003]. У дрозофилы основную часть piРНК составляет подкласс rasiРНК, то есть короткие РНК, образующиеся из ретротранспозонов и других повторов [Aravin et al., 2006]. piРНК ассоциированы со всеми белками семейства Piwi.

Механизм биогенеза piРНК плохо изучен. В герминальных тканях дрозофил, которые состоят из герминальных клеток и соматических фолликулярных клеток, окружающих их, работают различные пути биогенеза piРНК [Li et al., 2009; Malone et al., 2009]. Как отмечалось выше, большинство из уникальных piРНК получены из богатых транспозонами гетерохроматиновых локусов, таких как flamenco [Brennecke et al., 2007;

Кластеры piРНК содержат антисмысловые Yin and Lin, 2007].

последовательности к мРНК активных транспозонов, эти антисмысловые РНК ассоциированы с белками Piwi и Aubergine семейства PIWI [Brennecke et al., 2007; Gunawardane et al., 2007; Yin and Lin, 2007]. Смысловые РНК из кластеров piРНК ассоциируются с белком Argonaut (Ago3) [Brennecke et al., Транскрипты 2007; Gunawardane et al., 2007]. piРНК-кластеров экспортируются в цитоплазму, где множество факторов осуществляют биогенез piРНК. Большая часть открытых факторов располагаются в точке рядом с ядерной оболочкой клетки: Yb-тела у соматических клеток яичников и внутриклеточные гранулы в генеративных клетках. Yb-тела и внутриклеточные гранулы ассоциированы с митохондриями, а важный фактор биогенеза piРНК Zucchini интегрирован в мембрану митохондрии [Ipsaro et al., 2012; Nishimasu et al., 2012; Saito et al., 2010]. Антисмысловые РНК, связываясь с белками Piwi и Aubergine, осуществляют разрезание смысловой последовательности транскрипта активного транспозона на расстоянии 10 нуклеотидов от 5’ конца. Продукты такого разрезания связываются с Ago3. Комплекс piRNA–Ago3 осуществляет вырезание piРНК противоположной полярности, ассоциированной с Aub и Piwi, и т.д.

Таким образом, в результате этого процесса в клетке накапливаются короткие смысловые и антисмысловые РНК, перекрывающиеся на 10 п.н.

Этот процесс был назван «пинг-понг» (рис.7). После формирования piRISC комплексов происходит их транспортировка в ядро, где они осуществляют транскрипционный сайленсинг транспозонов [Sienski et al., 2012; Wang and Elgin, 2011; Le Thomas et al., 2013; Rozhkov et al., 2013].

Рис.7 Модель механизма амплификации piРНК - «Пинг-понг». [Brennecke et al., 2007].

В качестве источника первичных piРНК у D. melanogaster может выступать локус flamenco. Первичные piРНК, образованные из транскрипта локуса flamenco, являются «затравкой» для образования вторичных piРНК путем пинг-понг механизма уже с участием смысловых транскриптов канонических ретроэлементов [Brennecke et al., 2007].

–  –  –

Рис.8 Предположительная схема механизма контроля транспозиции ретротранспозонов у Drosophila melanogaster.

В процессе РНК-интерференции также задействованы белки семейства HP1. Гетерохроматиновые белки способны активировать транскрипцию кластеров piРНК. Также было показано взаимодействие белков HP1 с белками PIWI. У некоторых мутантов по генам hp1 наблюдается схожее с мутантами по генам РНК-интерференции фенотипическое проявление.

I.3.2. Регуляция посредством участия белков семейства HP1 У D.melanogaster, как и у многих эукариот, на долю гетерохроматина приходится значительная часть генома. В норме две хромосомы дрозофилы (Y и 4) почти целиком находятся в компактизованном состоянии. Несмотря на это, данные хромосомы содержат функциональные последовательности, транскрибирующиеся на определенных этапах онтогенеза [Sackton, Hartl, 2013]. Это подтверждает участие гетерохроматина в многоуровневой регуляции экспрессии генов.

Биологическая роль гетерохроматина в значительной степени остается не выявленной, и решение этого вопроса является одной из фундаментальных задач молекулярной генетики. Известно, что в этих районах локализуется большое количество повторяющихся последовательностей, основными представителями которых являются МГЭ.

Одним из первых негистоновым компонентом гетерохроматина, обнаруженным на политенных хромосомах D.melanogaster, стал белок Нр1a (heterochromatin protein 1a) [James, Elgin, 1986]. В структуре Hp1a (ген Su(var)2-5) выделяют три домена: хромодомен, хромотеневой и линкерный. Первые два домена являются высоко консервативными.

Хромодомен необходим для взаимодействия с хромосомными белками. Хромодомен имеет так называемый гидрофобный карман (специфическая последовательность аминокислот), который участвует в белок-белковых взаимодействиях. Мутации, связанные с заменой аминокислот в гидрофобном кармане белков Hp1a и POLYCOMB, нарушают их ассоциацию с хромосомми. Этот домен важен для взаимодействия Нр1а с N-концом гистонового белка Н3, когда последний неметилирован по лизину в позиции K9 [Bannister et al., 2001; Jacobs, Khorasanizadeh, 2002; Lachner et al., 2001; Nakayama et al., 2001].Также имеются доказательства прямого взаимодействия этого домена Hp1 с РНК [Piacentini et al., 2003].

В карбоксильном участке многих белков из хромо-суперсемейства имеется второй домен - хромотеневой домен. Присутствие только этого домена достаточно для связывания с гетерохроматином. Хромотеневой домен необходим для димеризации и взаимодействия с другими белками через имеющийся мотив PxVxL, где х – любая аминокислота [Smothers, Henikoff, 2000]. Достоверным партнером по взаимодействию является метилаза гистона Н3 Su(var)3-9HMTase. Принятая модель взаимодействия Нр1 с хроматином и распространение сигнала метилирования изображена на рис. 9. Этот механизм высоко консервативен и характерен для большинства эукариотических организмов, включая человека [Grewal, Область, расположенная между хромодоменом и Elgin, 2002].

хромотеневым доменом - линкерный домен - проявляет наименьшую консервативность аминокислотной последовательности. Помимо того, что этот домен соединяет два других домена Нр1, за счет него осуществляются несколько важных взаимодействий. Наряду с хромодоменом, он необходим для эффективного связывания с хроматином [Meehan et al., 2003]. В результате прямого контакта с ДНК, определяет правильный паттерн локализации на хромосоме [Smothers et al., 2001]. Фосфорилирование линкерного домена негативно сказывается на его ДНК-связывающую способность и приводит к смене ядерной локализации Нр1 [Badugu et al., 2005].

Рис. 9. Нр1a (heterochromatin protein 1) и его роль в поддержании гетерохроматина. а) Схематичное изображение основных доменов белка Нр1a и их основные функции; б) модель распространения гетерохроматина: хромодомен Нр1а взаимодействует с N-концом Н3, не метилированным по лизину 9, а его хромотеневой домен связывается метилазой гистона Н3 Su(var)3-9, осуществляющей метилирование [Grewal, Elgin, 2002].

Анализ распространения белка Нр1 на митотических и политенных хромосомах показал, что он является стабильным компонентом теломерных областей. Существует два основных пути, определяющих его локализацию на хромосоме: через узнавание метилированного гистона H3 хромодоменом, либо через связывания теломерной ДНК линкерной областью [Fanti et al., 1998;Fanti, Pimpinelli, 2008]. Это взаимодействие не является специфичным, поскольку наблюдается даже при удалении характерных для теломер D. melanogaster последовательностей МЭ Het-A и TART [Perrini et al., 2004]. У гетерозиготных по гену Su(var)2-5 мух, содержащих один из его мутантных аллелей, наблюдаются множественные теломерные слияния хромосом. Повреждение хромодомена не вызывает подобных хромосомных нарушений [Fanti et al., 1998], однако заметно возрастает транскрипция МГЭ Het-A и TART, что свидетельствует об его участии в сайленсинге теломер [Talbert et al., 1994].

–  –  –

Показано, что ДНК-связывающие белки у D. melanogaster, для которых продемонстрировано прямое взаимодействие как с ДКПретротранспозонами (17.6, springer, McClintock и др.) [Greil et al., 2003], так и с ретротранспозонами, не имеющими ДКП (HeT-A иTART) [Perrini et al., 2004], относятся к семейству Hp1.

Имеется доказательство взаимодействия белка Нр1а с 5’-UTR МГЭ ZAM, относящегося к группе Ty3/gypsy в эксперименте in vitro [Minervini et al., 2007]. Предполагаемое взаимодействие осуществляется благодаря имеющимся в повторах ретротранспозона инициаторным АТ-богатым участкам. Хромодомен Hp1а напрямую узнает эти участки, образуя ДНКбелковый комплекс, от которого в обоих направлениях распространяются Нр1а-ДНК-филаменты (рис.10).

Рис.10. Модель взаимодействия HP1а – ДНК. Инициаторный участок ДНК, необходимый для взаимодействия, отмечен красным цветом [Minervini et al., 2007] Через взаимодействие с фактором сборки нуклеосом CAF-1 Нр1а вовлечен в репликацию (Chromatin assembly factor I) гетерохроматина, осуществляемую в поздней S-фазе клеточного цикла. Для CAF-1 показана ассоциация с PCNA (Proliferating cell nuclear antigen). По ходу репликации гетерохроматиновых районов CAF-1 не только собирает ДНК-нуклеосомный комплекс, но и привлекает к ним Нр1а, который в последствие обеспечивает компактизацию [Dohke et al., 2008].

В геномах большинства эукариотических организмов имеется, по меньшей мере, один паралог гена Su(var)2-5. Как правило, новая копия гена накапливает определенное количество мутаций, меняющих функцию кодируемого ею белка. В геноме D. melanogaster произошло как минимум 5 дупликаций этого гена, что привело к появлению паралогов Нр1 (Нр1a-e), каждый из которых обладает своими отличительными чертами. Одно из первых доказательств существования нескольких белков семейства Нр1 было основано на их различной хромосомной локализации, а так же на отличиях их состава в тканевых образцах [Smothers, Henikoff, 2001].

Локализация Нр1а на хромосоме совпадает с районами метилированного гистона Н3 (Н3К9me). локализован в Hp1d гетерохроматине, в котором не обнаруживается данной модификации гистона Н3. Нр1с специфичен только для эухроматина, а Нр1b встречается как в гетеро- так и в эухроматине [Abel et al., 2009; Font-Burgada et al., 2008]. В отличие от описанных белков семейства Нр1, локализация Нр1е не связана с хроматином и, вероятно, зависит от фактора, характерного для герминальных тканей самцов.

Анализ экспрессии паралогов Нр1 у D. melanogaster показал, что Нр1а, Нр1b и Нр1с экспрессируются во всех тканях взрослой мухи, в то время как Нр1d и Нр1е характерны для герминальных тканей самок и самцов соответственно [Vermaak et al., 2005].

Считается, что каждый из паралогов выполняет специфичную функцию, а не дублирует уже имеющуюся. В качестве доказательства можно привести эксперименты, в которых было показано, что выключение гена Su(var)-2-5 (НР1а) является летальным [Eissenberg & Hartnett, 1993], а инактивация гена rhino (Нр1d) приводит к стерильности у самок [Volpe et al., 2001].

Как уже было отмечено, хромосомная локализация Нр1b носит промежуточный характер таковой для Нр1а и Нр1с (гетерохроматин и эухроматин соответственно). Из филогенетического анализа следует, что последовательность Нр1b является химерной: его хромодомен наиболее близок к таковому у Нр1с, а хромотеневой - к соответствующему домену Нр1а. Это может частично объяснить некоторые промежуточные свойства

Нр1b [Smothers, Henikoff, 2001].

Нр1с функционально очень отличается от Нр1а, в первую очередь, по особенности его локализации на хромосоме. В то время как Нр1а считается маркером гетерохроматина, белок Нр1с обнаруживает себя исключительно в районах транскрипционно активного хроматина, за исключением экспериментов по его сверхэкспрессии [Abel et al., 2009; Font-Burgada, 2008]. В то время как Нр1a и Hp1b подавляют транскрипцию генов, Нр1с оказывает прямо противоположный эффект, т.е. положительно регулирует транскрипцию [Abel et al., 2009; Font-Burgada, 2008].

В экспериментах с очищенным белком Нр1с продемонстрировано его взаимодействие с двумя родственными транскрипционными факторами WOC (without children) и ROW (relative of woc) [Abel et al., 2009; FontBurgada, 2008]. Хромотеневой домен Нр1с напрямую взаимодействует с PxVxL мотивом в аминокислотной последовательности белка WOC [Coustham et al., 2006]. Белок WOC содержит домен цинковые пальцы, ROW - АТ-hook-домен, за счет взаимодействия с которыми Нр1с направляется в характерные для него районы эухроматина (рис. 11).

Характерной особенностью гена rhino (Нр1d) является высокая скорость накопления замен. Анализ последовательностей гена в разных популяциях D. melanogaster показал, что все три домена белка – хромо-, хромотеневой и линкерный - Нр1d находятся под действием движущего отбора [Vermaak et al., 2005].

Характерный паттерн экспрессии, отличающийся от паттернов других белков семейства Нр1 (высокий уровень транскрипта наблюдается только в герминальных тканях самок), фенотип мутантов (стерильность самок), а также высокая скорость эволюции гена rhino указывает на имеющийся генетический конфликт. Предполагается, что генетический конфликт может возникнуть в результате взаимодействия между геномом D. melanogaster и геномами МГЭ [Vermaak et al., 2005].

Рис. 11. Участие белков WOC и ROW D. melanogaster в хромосомной локализации белка Нр1с и регуляция экспрессии его транскрипта: а) При низком или нормальном уровне экспрессии Нр1с в эухроматине имеется достаточное количество предобразованных комплексов WOC-ROW, к которым Нр1с проявляет высокую аффинность. При сверхэкспрессии Нр1с сначала занимает все доступные высокоаффинные сайты WOС-ROW, в дальнейшем переключается на менее аффинные метилированных гистонов H3K9me. б) в регуляторной области гена, кодирующего белок Нр1с, находится сайт посадки WOC, через взаимодействие с которым осуществляется саморегуляция транскрипции Нр1с [Coustham et al., 2006].

Известно, что перемещения МГЭ происходят преимущественно в половых клетках самок. В последних работах имеются подтверждения, что Hp1d действительно участвует в защите ДНК герминальных тканей от перемещения МГЭ [Klattenhoff et al., 2009]. Фенотип мутантов по гену rhino очень похож фенотипы мутантов по генам Piwi-пути [Gillespie, Berg, 1995] – значительно возрастает транскрипционная активность МГЭ, в период развития половых органов самок в клетках накапливаются двуцепочечные разрывы ДНК, в ответ на появленние которых активируются соответствующие сигнальные пути [Klattenhoff et al., 2009].

У мутантов rhino обнаруживается сокращение примерно 75% тотального количества piРНК, приводящее к значительному увеличению экспрессии МГЭ. Например, экспрессия Het-A возрастает в 70 раз [Brennecke et al., 2007]. Также показано, что среди всего разнообразия малых некодирующих РНК у данных мутантов наблюдается сокращение исключительно фракции piРНК, которые участвуют за «ping-pong»

механизме амплификации транскрипта-предшественника piРНК.

–  –  –

МГЭ, избегающие подавление их транскрипции белком Нр1d, являются движущей силой эволюции гена rhino. Существуют две взаимонеисключающие гипотезы: в линкерном домене Hp1d постепенно накапливается определенное количество замен, достаточное для узнавания последовательности МГЭ. Узнавание белком Нр1d интегрированной копии МГЭ ведет к появлению и осуществляется сайленсинг piРНК соответствующего МГЭ. Согласно второй гипотезе, МГЭ в преинтеграционном комплексе узнается Hp1d (как в результате прямого взаимодействия с РНК/ДНК МГЭ, так и через взаимодействие с белковым аппаратом преинтеграционного комплекса) и осуществляется его направленная транспозиция в piРНК кластер [Vermaak et al., 2009].

Рис. 12. Функция и эволюция гетерохроматинового белка Hp1d D.

melanogaster. а) Предполагаемый механизм участия Hp1d в подавлении транскрипции МЭ путем piРНК интерференции; б) две альтернативные модели эволюции доменов Hp1d как результат более сильной защиты против МЭ, либо в ответ на появление новых [Vermaak et al., 2009].

Таким образом, в ходе эволюции возникают различные способы регуляции транспозиций МГЭ. На сегодняшний день для D. melanogaster известно несколько механизмов, действующих на определенных этапах жизненного цикла МГЭ. Подавление экспрессии МГЭ может осуществляться как за счет РНК интерференции, так и напрямую путем компактизации районов хромосом, где расположены ДНК-копии МГЭ.

Показано, что в данном процессе переключения районов ДНК в неактивное транскрипционное состояние принимают участие белки семейства Нр1.

–  –  –

В работе использованы линии D. melanogaster: SS (мутантная по гену flamenco, w1) и линия D32 с фенотипом flamenco+ из коллекции кафедры генетики МГУ. Линии культивировали в стандартных условиях, на общепринятой агаризованной питательной среде при температуре 25 оС [Медведев, 1968].

II.1.2. Штаммы Escherichia coli

В работе использованы следующие штаммы: JM109 (endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ (lac-proAB) e14- [F' traD36 proAB+ lacIq lacZM15] hsdR17(rK-mK+)) для клонирования ПЦР фрагментов, BL21 (E.

coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal [malB+]K-12(S)) для экспрессии белка HP1a.

–  –  –

В работе использовали векторы: pAL-TA (Ampr, Plac, lacZ) (Евроген), pET30-a ( Kmr, lacI)(EMD Biosciences), pCaSpeR-hs (Ampr, mini-white, hsp70)(DGRC), pEGFP-n1 (Kmr, EGFP) (Clontech).

–  –  –

II.2.1. Приготовление компетентных клеток E. coli Приготовление компетентных клеток E. coli осуществляли по стандартным методикам [Sambrook, Russel, 2001]. Необходимый штамм E.coli засевали в пробирку с питательной средой LB и инкубировали при 37°С в течение ночи. 1,5 мл ночной культуры добавляли в 30 мл теплой (37°С) жидкой среды LB и инкубировали при 37°С 90 минут при постоянном помешивании. Содержимое колбы вносили по 1,5 мл в пластиковые эппендорфы объемом 1,7 мл и центрифугировали в охлаждаемой центрифуге 5415R (Eppendorf) при 5000 об/мин и 4°С 3 минуты, далее к осадку добавляли еще по 1,5 мл культуры и повторяли центрифугирование Осадок ресуспендировали в 500 мкл 100mM раствора CaCl2 при 4°С и заново осаждали в тех же условиях. Затем осадок ресуспендировали в 150 мкл 100mM раствора CaCl2 и инкубировали 4 часа при 4°С. После чего в пробирки добавляли 75 мкл 45% глицерина и хранили при -20°С.

II.2.2. Трансформация E. сoli

Для трансформации 100 мкл компетентных клеток, размороженных на ледяной бане, смешивали с 1-20 мкл плазмидной ДНК (100 нг), или 20 мкл лигазной смеси и инкубировали во льду в течение 45 мин. Затем пробирки помещали на 1 мин в термостат при 42°С и быстро переносили в лед на 2-3 мин. После этого клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем добавляли к ним 0,6 мл среды LB и переносили в стерильные стеклянные пробирки с ватно-марлевыми пробками. Культуру инкубировали при 37°С в течение 3 час при постоянном помешивании. 80-100 мкл культуры рассевали шпателем на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей соответствующие антибиотики, и инкубировали в течение ночи (12-16 час) при 37°С.

II.2.3. Выделение хромосомной ДНК

50-100 мух помещали в пробирку (Eppendorf) объемом 1,7 мл и добавляли 500 мкл свежеприготовленного рабочего раствора (400 мкл 0,1 M раствора Tris–HCl (pH 9.0), 100 мкл 10% раствора SDS, 7 мкл DEPC (Diethylpyrocarbonate). Мух растирали вручную стерильным тефлоновым пестиком до получения гомогенной смеси. Полученный гомогенат инкубировали при температуре 70°С 30 минут, добавляли 116 мкл 5М раствора ацетата калия и инкубировали при 0°С 30 минут. Затем добавляли 1 объем смеси фенол-хлороформ (1:1), аккуратно перемешивали и центрифугировали 10 мин на центрифуге MiniSpin (Eppendorf) при 13400 об/мин. Супернатант переносили в чистую пробирку с 350 мкл изопропанола. Пробу инкубировали при комнатной температуре 5 мин и центрифугировали при 13400 об/мин 15 мин. Супернатант сливали, осадок ДНК промывали: добавляли 500 мкл 70% раствором этанола, затем центрифугировали 5 мин. Осадок ДНК подсушивали 5 минут на столе и растворяли в 30 мкл деионизованной воды.

II.2.4. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli

Для выделения плазмидной ДНК отдельную колонию трансформантов засевали в 2 мл жидкой среды LB с антибиотиком и инкубировали в течение ночи при 37°С. 1,5 мл культуры помещали в пластиковые пробирки объемом 1,7 мл и центрифугировали на центрифуге MiniSpin (Eppendorf) при 13400 об/мин 30 сек, супернатант удаляли.

Осадок ресуспендировали в 350 мкл STET (50мМ трис-HCl, 50 мМ EDTA, 5% TritonX-100, 8% сахароза, pH 8.0), затем добавляли 25 мкл водного раствора лизоцима (10 мг/мл), перемешивали и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Далее пробирку помещали в кипящую водяную баню на 40 сек, центрифугировали в течение 15 мин при 13400 об/мин, затем удаляли осадок. К супернатанту добавляли 175 мкл 7,5 М ацетата аммония и 310 мкл изопропанола. Смесь перемешивали на вортексе, инкубировали 15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали 15 мин при 13400 об/мин. Супернатант удаляли, осадок промывали 500 мкл 70% этанола и центрифугировали 5 мин при 13400 об/мин. После удаления супернатанта осадок подсушивали, растворяли в 20-50 мкл деионизованной воды и хранили при –20°С.

II.2.5. Сбор тканей для последующего выделения РНК

Мух анестезировали диэтиловым эфиром и вскрывали под бинокулярным микроскопом с помощью препаровальных игл. Органы (яичники, семенники) и корпуса (по 20-30 мг) собирали в отдельные пробирки объемом 1,5 мл с заранее добавленным реагентом для выделения суммарной РНК ExtractRNA (Евроген).

II.2.6. Выделение тотальной РНК

Выделение тотальной РНК осуществляли с помощью реактива ExtractRNA (Евроген) в соответствии с протоколом фирмы производителя с незначительными модификациями. 15-20 мг исследуемого образца (15 особей) помещали в пробирку «эппендорф», добавляли 100 мкл раствора ExtractRNA и растирали с помощью гомогенизатора со сменными пластиковыми пестиками до исчезновения крупных фрагментов ткани.

Добавляли еще 400 мкл раствора ExtractRNA, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 10 мин. Далее добавляли объема хлороформа, несколько раз перемешивали до образования гомогенной эмульсии и инкубировали при +4°С 20 мин.

Полученную смесь центрифугировали 15 мин при 16000 g, 250 мкл водной фазы, содержащей РНК, переносили в пробирки с 300 мкл изопропанола, перемешивали, инкубировали 20 мин при +4°С для осаждения РНК и центрифугировали 15 мин при 16000 g. Осадок промывали 70%-ным этанолом, подсушивали и растворяли в 30 мкл деионизованной воды. Растворы РНК хранили в морозильной камере при -20°С. Количество выделенной РНК измеряли спектрофотометрически на приборе Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific).

II.2.7. Обработка ДНКазой

Перед постановкой реакции обратной транскрипции образцы РНК обрабатывали ДНКазой I (Fermentas) согласно протоколу фирмы. Для обработки ДНКазой брали 4 мкг РНК, реакцию проводили в объеме 40 мкл при 37°С в течение 1 час. Реакцию останавливали добавлением EDTA (конечная концентрация 2,5 mM), для инактивации ДНКазы пробу прогревали в течение 10 мин при 65°С.

II.2.8. Обратная транскрипция

Для обратной транскрипции использовали набор MMLV-RT Kit (Евроген). 500 нг обработанной ДНКазой РНК смешивали с 1 мкл гексануклеотидного праймера со случайной последовательностью, доводили объем до 9 мкл, прогревали 2 мин при 70°С, затем помещали пробы в лед. К смеси РНК и праймера добавляли буфер для обратной транскрипции, ревертазу, смесь нуклеотидов и дитиотритол в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Пробы инкубировали сначала 5 мин при комнатной температуре, затем 50 мин при 40°С. Ревертазу инактивировали прогреванием в течение 10 мин при 70°С.

II.2.9. Полимеразная цепная реакция

Приготовление реакционной смеси выполняли по протоколу фирмы «Fermentas». Реакцию проводили в амплификаторе ТП4-ПЦР-01-«Терцик»

(ДНК-Технология). В качестве матрицы использовали хромосомную ДНК и кДНК, полученную на матрице РНК D. melanogaster., используя Taqполимеразу (2.5 ед/мкл). Концентрация MgCl2– 2.5 мМ, каждого праймера

– 0.4 мкМ на реакцию. В качестве матрицы использовали геномную ДНК или кДНК, полученную на РНК, D. melanogaster анализируемых линий с парами праймеров, подобранными для целей конкретного эксперимента.

При ПЦР с кДНК в качестве контроля амплифицировали кДНК гена alphatubulin.

–  –  –

30 циклов: плавление 30 сек при 95°С, отжиг праймеров 1 мин 2) при 55-60°С (в зависимости от температуры плавления праймеров) (табл.

1) и синтез 1-2 мин (в зависимости от длины фрагмента) при 72°С.

–  –  –

II.2.10. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени Амплификацию проводили в объеме 25 мкл в течение 40 циклов в амплификаторе MiniOpticon Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories).

Использовали реакционная смесь M-428 фирмы «Синтол», содержащую флуоресцентный краситель SYBR Green I. Концентрация MgCl2 – 2.5 мМ, каждого праймера – 0.4 мкМ на реакцию. Параметры цикла: денатурация С, 30 сек; отжиг праймеров - 55°С, 30 сек; элонгация - 72°С, 1 мин.

Продукт ПЦР также исследовали с помощью электрофореза. Анализ результатов ПЦР проводили с помощью пакета программ Bio-Rad CFX Manager (версия 1.6.541.1028). Статистическую значимость различий в относительном уровне экспрессии оценивали с помощью критерия МаннаУитни.

II.2.11.Клонирование в плазмидах и получение векторных конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов Клонирование ПЦР-фрагментов осуществляли в векторе pAL-TA по протоколу фирмы производителя Копии гена (Евроген). hp1a переклонировали в плазмиду pET30a по сайтам рестрикции Not I и Nde I.

Амплификаты регуляторных областей ретротранспозонов лигировали с плазмидой pAL-TA по протоколу фирмы производителя (Евроген). Затем фрагмент вырезали по заданным сайтам рестрикции Xho I/HindIII и EcoR I и переклонировали его в векторную плазмиду pEGFP-n1, таким образом, чтобы регуляторные области элемента лежали в одной рамке считывания с репортерным геном GFP. Конечным этапом было переклонирование фрагмента с ДКП и нетранслируемой областью, слитого с репортерным геном по сайтам рестрикции Xho I/HindIII и NotI в плазмиду pCaSpeR-hs. Рестрикцию проводили по протоколам фирмы-производителя (Fermentas).

Состав рестрикционной смеси: 2 мкл ДНК образца, 1 мкл 10х буфера, 0,1 мкл рестриктазы (1 ед.а.), 7 мкл Н2Оmq. Смесь инкубировали при 37°С в течение 1-2 час.

Для лигирования с вектором использовали T4 ДНК-лигазу (Fermentas) согласно протоколу фирмы. Лигирование проводили в пробирке объемом 0,5 мл. Объем реакционной смеси составлял 15 мкл.

–  –  –

Электрофорез проводили с напряжением 5 В/см в 1% агарозном геле (0,5 г агарозы; 50 мл ТАЕ [40mM трис,20 mM уксусная кислота, 2mM EDTA]; 5 мкл бромистого этидия [0,5 мг/мл]).

II.2.13. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля Фрагмент ДНК выделяли из агарозного геля набором Clean up mini (Евроген), в соответствии с протоколом, приложенным к набору.

Вырезанный фрагмент геля с ДНК помещали в пробирку объемом 1,5 мл. К вырезанному из геля фрагменту ДНК добавляли связывающий раствор в соотношении 1:3 (к 100 мкг вырезанного фрагмента добавляли 300 мкл связывающего раствора). Инкубировали смесь при 55°С в течение 10 мин. Переносили раствор на колонку и центрифугировали 30 сек, супернатант сливали. Добавляли 700 мкл промывочного раствора на колонку и центрифугировали 1 мин Супернатант сливали. Колонку переносили в новую пробирку, добавляли 15 мкл буфера для элюции на колонку и центрифугировали 1 мин.

–  –  –

Для получения рекомбинантного белка штамм E.coli BL21 трансформировали плазмидой pET30, содержащей полноразмерную копию гена hp1a. В колбу с 200 мл бактериальной культуры, находящейся в логарифмической фазе роста, добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали при комнатной температуре в течение 16 час.

Полученную культуру осаждали центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин, осадок ресуспендировали в 10 мл буфера для нанесения на колонку (0,5М NaCl, 5мМ имидазол, 10мМ фосфатный буфер pH 7,4 1мМ PMSF) и разрушали клетки ультразвуковым гомогенизатором УЗГ-0,1/22 (УЗТ). Полученный лизат центрифугировали 30 мин при 16000 g, белок выделяли из супернатанта с помощью колонки HisTrap FF (GE Healthcare).

В протокол, рекомендованный производителем, был добавлен этап промывки белка растворами, содержащими 50 и 150мМ имидазола.

Качество полученного препарата оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

II.2.16. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии MOPS Электрофорез проводили в камере для вертикального электрофореза VE-10 (Хеликон) в 10%-ном ПААГ. К 3,3 мл 30%-ного акриламида (29 г акриламида к 1 г бисакриламида) добавляли 4 мл 1М раствора Tris-HCl pH 6,8 и доводили водой H2Omq до объема 10 мл. Для инициации радикальной полимеризации добавляли 100 мкл 10%-ного APS. В качестве катализатора использовали 30 мкл ТЕМЕД.

Cостав верхнего буфера: 50mM MOPS, 50 mM Tris-HCl pH 6,5, 0,1% SDS. Нижний буфер - 50 mM Tris-HCl pH 6,8. Форез проводили в течение 2-3 час при напряжении 150 В.

II.2.17. Окраска полиакриламидных гелей красителем Coomassie G-250 Полиакриламидные гели отмывали от SDS в течение 15 мин в 10% растворе изопропанола, затем окрашивали 30 мин в 0,05%-ном растворе Coomassie brilliant blue G-250, содержащем 20% этанола и 2% трихлоруксусной кислоты. После окрашивания гель отмывали в нескольких сменах горячей дистиллированной воды до проявления полос и исчезновения фона.

II.2.18. Диализ растворов белков

Диализ растворов белков проводили в диализных трубках SERVAPOR (Serva). 1 мл раствора белка в буфере для элюции с колонки HisTrap FF диализовали против 200 мл раствора 10mM Tris-HCl, 50 mM KCl pH 7,4 при 4°С в трех сменах буфера: по 3 час в двух первых сменах и ночь в последней смене. Выпавший осадок отделяли центрифугированием в течение 30 мин на охлаждаемой центрифуге 5415R (Eppendorf) при 13400 об/мин, супернатант собирали и использовали в дальнейшей работе.

–  –  –

Связывание белка проводили в пробирке объемом 0,5 мл в буфере, содержащем 10mM Tris-HCl, 0,5M KCl pH 7,4 в течение 30-60 мин при 0С.

Очищенные фрагменты смешивали с мкг белка. Связывание анализировали в 8%-ном ПААГ: к 2,65 мл 30%-ного акриламида (29 г акриламида к 1 г бисакриламида) добавляли 0,5 мл 10TBE. Затем к смеси добавляли 1 мл 80%-ного глицерина и доводили ее до объема 10 мл H2Omq. Для инициации радикальной полимеризации добавляли 100 мкл 10%-ного APS. В качестве катализатора использовали 30 мкл ТЕМЕД.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III.1. Анализ транскрипции локуса flamenco Локус flamenco представляет собой место скопления дефектных копий МГЭ. Предполагается, что транскрипт flamenco участвует в процессе РНК-интерференции МГЭ, выступая в роли молекулыпредшественника, дающей начало малым РНК, ассоциированных с белком PIWI (piРНК). У инсерционных мутантов по локусу flamenco малые РНК, взаимодействующие с белком PIWI, не образуются [Brennecke et al., 2007].

Рис. 13. Диаграмма транскрипции РНК в локусе flamenco.

А) Количественный ОТ-ПЦР анализ транскрипции в 4-х анализируемых точках района flamenco в яичниках мух линий flamenco+ (D32) и SS.

Б) Количественный ОТ-ПЦР анализ транскрипции в 4-х анализируемых точках района flamenco в семенниках мух линий flamenco+ (D32) и SS.

Мы предположили, что в линии SS с фенотипом flamenco-, нарушен механизм образования малых РНК. Одной из причин нарушения может быть отсутствие транскрипта-предшественника из-за нарушения инициации транскрипции. Другой причиной может быть нарушение его дальнейшего процессинга: сплайсинга или расщепление до малых РНК.

Нами был проведен анализ транскрипции РНК в линиях SS (мутант) и D32 (дикий тип) в четырех точках локуса flamenco (рис. 13).

Исследуя уровни транскрипции во взятых точках на РНК семенников линий дикого типа и мутанта, мы не обнаружили принципиальных отличий в уровнях транскрипции. В яичниках общий уровень транскрипции в анализируемых точках 1 и 2 локуса flamenco примерно в 2 раза ниже в линии SS, чем в линии D32, что может быть связано со структурными особенностями района инициации транскрипции предшественника в этих линиях [Нефедова и др., 2007]. При этом в точках 3 и 4 в линии D32 наблюдается снижение уровня транскрипции в 30 и в3 раза соответственно. У линии SS такого снижения не наблюдалось. Повидимому, в линии D32 происходит процессинг РНК-предшественника, считываемого в этом районе, результат которого мы наблюдаем на графике.

Отсутствие различий уровней транскрипции во всех точках в линии SS можно объяснить нарушением процессинга первичного транскрипта.

III.2. Молекулярно-генетический анализ сплайсинга локуса flamenco

РНК локуса flamenco подвергается альтернативному сплайсингу [Goriaux et al., 2014]. Сплайсированные формы РНК локуса flamenco переносятся в ядерную структуру, именуемую DotCOM. Оттуда они переходят в цитоплазму в Yb-тело, где содержатся компоненты, процессирующие малые РНК из длинных транскриптов [Saito et al, 2010].

Предполагают, что сплайсинг piРНК кластеров необходим для облегчения переноса их длинных транскриптов из ядра в цитоплазму. Мы предположили, что в нашей линии SS сплайсинг может быть нарушен, в результате чего нарушается перенос и дальнейший процессинг транскриптов flamenco.

Для проверки нашей гипотезы мы провели ОТ-ПЦР-анализ 5’области flamenco размером 10 т.п.н., в которой были картированы различные альтернативно сплайсированные формы РНК [Goriaux et al., 2014].

Мы подобрали праймеры к экзонам, которые имеются в большей части альтернативно сплайсированных форм локуса flamenco (области в которых отсутствовали копии МГЭ и картировались как экзоны) таким образом, чтобы в случае нарушения сплайсинга мы смогли бы это установить, анализируя длину получаемых ПЦР-фрагментов.

Качественный анализ методом ОТ-ПЦР показал, что все альтернативно сплайсированные формы присутствуют как в линии D32, так и в линии SS (рис. 14.В).

Рис. 14 Альтернативный сплайсинг РНК локуса flamenco. А - Схема вариантов альтернативного сплайсинга РНК, считываемой в локусе flamenco.

Буквами A, B, C обозначены сплайсированные формы, полученные с одной пары праймеров: exon1f-exon2r, exon1f-exon3r, exon1f-exon4r соответственно.

Прозрачными прямоугольником обозначен вариант альтернативной формы сплайсинга РНК, которая не была описана ранее. Б - количественный анализ сплайсированных РНК (А, В, С) локуса flamenco в яичниках мух линий flamenco+ (D32) и SS. В - электрофореграмма ПЦР-продуктов кДНК, полученных на основе РНК, выделенной из яичников, с праймеров exon1f-exon2r, exon1f-exon3r и exon1fexon4r.

Количественный анализ показал, что в линии D32 сплайсированных форм значительно меньше, чем у линии с фенотипом flamenco (рис.14, Б).

Это можно объяснить накоплением сплайсированного транскрипта в линии SS. Вероятно, один из факторов, отвечающих за дальнейший процессинг транскрипта утратил свою функцию.

III.3. Анализ экспрессии генов системы РНК-интерференции

Как мы установили, причиной фенотипа flamenco может быть нарушение процессинга РНК локуса flamenco. Предполагается, что flamenco является кластером piРНК. Как было описано в параграфе I.3.1.2., в процессе piРНК-интерференции задействованы белки семейства PIWI.

Мы сравнили уровни экспрессии генов, кодирующих данные белки системы РНК-интерференции (aub, piwi и ago3), в линиях SS и D32. Для гена piwi ранее нами было показано комплементарное взаимодействие с локусом flamenco [Урусов и др., 2013]. Также мы измерили уровень экспрессии гена zuc. Некоторые литературные данные указывают на то, что данный ген кодирует эндонуклеазу, вовлеченную в первичный процессинг предшественника piРНК [Handler et al., 2013, Ipsaro et al., 2012; Nishimasu et al., 2012; Saito et al., 2010]. Существенных отличий по транскрипции данных генов обнаружено не было (рис. 15).

Рис. 15. Уровень экспрессии на уровне транскрипции генов системы РНК-интерференции ago-3, aub, zuc и piwi в яичниках в линиях D32 (дикий тип) и SS (flamenco).

Полученные данные указывают на отсутствие нарушений в работе данных генов в линии SS. Тем не менее, наиболее вероятной причиной фенотипа flamenco является нарушение процессинга транскрипта кластера Следовательно, существуют другие гены-кандидаты, flamenco.

участвующие в процессировании транскрипта flamenco на piРНК. В качестве таких кандидатов можно рассматривать гены Yb, Armi, Vret, Shu, Gawky, Pacman, Patr-1, для которых недавно было показано участие в процессировании первичных транскриптов piРНК-кластеров [Handler, 2014].

III.4. Анализ роли белков семейства HP1 в регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy Как отмечалось выше, белки семейства HP1 принимают участие в регуляции транспозиции МГЭ. У мутантов по генам hp1 наблюдалось снижение количества piРНК со стороны основных кластеров 42AB/cluster1, cluster 2 и flamenco [Basquin et al., 2014]. Кроме того, белки HP1 влияют на транскрипцию самих ретротранспозонов, путем взаимодействия с их регуляторными областями. Мы решили исследовать их влияние на регуляцию экспрессии ретротранспозонов группы gypsy с обеих сторон (прямое и опосредованное).

III.4.1. Анализ экспрессии генов семейства hp1 Мы провели анализ экспрессии генов, кодирующих белки семейства НР1 в линии SS с фенотипом flamenco [Лавренов и др., 2014].

Предположительно, нарушения экспрессии генов hp1 могли повлиять на активность ретротранспозонов группы gypsy. Основные паралоги гена hp1 (hp1a, hp1b, hp1c) экспрессируются во всех тканях, поэтому анализ их экспрессии проводили на препаратах тотальной РНК. Гены hp1d и hp1e экспрессируются исключительно в герминальных тканях D. melanogaster [Vermaak, Malik, 2009], поэтому кДНК синтезировали на основе РНК, выделенной из яичников и семенников соответственно.

Рис. 16. Уровень экспрессии на уровне транскрипции генов, кодирующих белки семейства НР1 в линиях D32 (дикий тип) и SS (flamenco).

А) Экспрессия генов hp1a, hp1b и hp1c в целых мухах. Б) Экспрессия гена hp1d в яичниках. В) Экспрессия гена hp1e в семенниках.

По полученным нами данным уровень экспрессии генов hp1a, hp1b и hp1c в линии SS не отличается от уровня экспрессии дикого типа (рис. 16, А). Это свидетельствует о том, что фенотип flamenco в линии SS не вызван нарушением экспрессии данных генов. Этого следовало ожидать, так как известно, что обычно мутации в этих генах летальны или вызывают грубые дефекты в развитии мух [Kellum, Alberts, 1995]. В более поздних работах утверждалось, что некоторые мутации в гене hp1a вызывают снижение транскрипции кластеров piРНК и содержание малых РНК примерно на 25%, но, тем не менее, не повышают уровни транскрипции всех элементов, контролируемых данными кластерами. Мутации в генах hp1d и hp1е не летальны, но могут вызывать стерильность у самок. Уровень экспрессии гена hp1d в линии SS оказался примерно в 2 раза ниже по сравнению с диким типом (рис. 16, Б). Полученные данные позволяют предполагать, что низкая экспрессия hp1d может вносить вклад в формирование фенотипа flamenco-. Ген hp1e в линии SS экспрессируется, в основном, на уровне D32 (рис. 16, В), и, таким образом, не участвует в формировании фенотипа flamenco.

Стоит отметить, что для гена hp1d(rhino) уже демонстрировалось участие в инициации транскрипции двуцепочечных кластеров piРНК [Klattenhoff, 2009]. Хотя flamenco считается одноцепочечным кластером, мы все же заметили некую корреляцию в снижении экспрессии hp1d и flamenco в яичниках линии SS. Справедливо будет предположить, что эти снижения взаимосвязаны и гены каким-то образом взаимодействуют друг с другом.

–  –  –

Для получения рекомбмнантного белка HP1a, мы амплифицировали полноразмерную копию гена hp1a с кДНК, полученной на основе РНК линии дикого типа. Полученный фрагмент мы лигировали с плазмидой pAL-TA. Затем после выделения плазмиды pAL-TA-hp1a из культуры клеток, фрагмент вырезали по сайтам рестрикции и лигировали с вектором pET-30a. Плазмида pET30 несет в себе промотор, индуцируемый Рис.17 Плазмида pET30 с клонированным полноразмерным hp1a и электрофореграмма смыва с His-Tag-колонки, содержащих белок. На плазмиде отмечены сайты рестрикции, по которым была заклонирована полноразмерная копия hp1a, ген устойчивости к канамицину и ген lac-репрессора, а также His-tag последовательность. На электрофореграмме стрелками отмечены различные формы белка HP1a. В качестве маркера использовался Prestained Protein Molecular Weight Marker (20-120 kDa).

IPTG, необходимый для экспрессии клонированного гена, и последовательность ДНК, кодирующую шесть идущих подряд гистидинов, позволяющую выделять белок с помощью аффинной хроматографии на His-Tag-колонках. Мы экстрагировали растворимую фракцию белка и выделили целевой белок с помощью аффинной хроматографии на His-Tagколонке. После очистки белка от солей и избытка имидазола с помощью диализа мы провели электрофорез в ПААГ.

Полученный рекомбинантный белок был представлен в трех формах:

мономере, димере и тримере. Димеры и тримеры HP1a образуются благодаря хромо-теневому домену белка в результате кросс-линкинга Для дальнейших экспериментов мы использовали [Zhao, 2000].

полученный белок с концентрацией 1,25 мкг/мкл.

III.4.2.2. Получение генетических конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов группы gypsy Для изучения транспозиционной активности ретротранспозонов группы gypsy in vivo мы разработали схемы получения векторных конструкций, содержащих длинные концевые повторы (ДКП) элементов группы gypsy, слитые с репортерным геном GFP. Известно, что ДКП элементов группы gypsy содержат не только промотор, но и 5’нетранслируемые области элементов, регулирующие экспрессию генов ретротранспозонов. Поэтому для слияния с геном GFP были выбраны последовательности ДКП, которые содержат исключительно промотор, и последовательности, которые содержат промотор с прилегающей к нему с 3’-конца нетраслируемой областью. С этой целью мы подобрали праймеры, имеющие сайты рестрикции, необходимые для дальнейшего переклонирования в вектор pEGFP-n1. Мы выбрали 6 элементов из группы gypsy: по 2 элемента из каждой подгруппы Idefix (rover, 17,6), ZAM (ZAM, tirant) и gypsy (gypsy, Springer). У некоторых элементов в нетранслируемой области имеются тандемные повторы. Предполагают, что они играют роль энхансеров, а также выступают в роли сайтов для связывания с регуляторными белками [Minervini et al., 2007; Morozova et al., 2004;

Olovnikov et al., 2007]. Число тандемных повторов может варьировать. В геномах разных линий D. melangaster имеются копии элементов, имеющие разное количество тандемных повторов в нетранслируемых областях. Так, у элементов tirant и ZAM имеются копии, содержащие 2-6 повторов и 1-3 повтора соответственно. При амплификации регуляторных областей этих элементов, мы столкнулись с тем, что на электрофореграмме наблюдались полосы разной длины, отличавшиеся размером примерно в 100 п.н. Для экспериментов мы постарались получить все возможные полиморфные варианты и включить их в наши конструкции.

После амплификации областей ДКП и прилегающей 3’нетраслируемой области, мы лигировали полученный амплификат с плазмидой pAL-TA. Затем мы вырезали фрагмент по заданным сайтам рестрикции и переклонировали его в векторную плазмиду pEGFP-n1, таким образом, чтобы регуляторные области элемента лежали в одной рамке считывания с репортерным геном GFP. Конечным этапом было переклонирование фрагмента с ДКП и нетранслируемой областью, слитого с репортерным геном в плазмиду pCaSpeR-hs. Данную плазмиду применяют в качестве вектора для инъекции в эмбрионы мух. В плазмиде содержится последовательность гена pCaSpeR-hs mini-white, выступающего селективным маркером для отбора трансгенных особей (рис. 18).

Рис.18 Схема получения векторных конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов группы gypsy pCasper:LTR-UTREGFP. Показана область амплификации регуляторной части ретротранспозонов группы gypsy. Клонирование фрагмента в плазмиду pEGFP-n1 осуществлялось по сайтам Xho I и EcoRI. Переклонирование в pCasper – по сайтам XhoI и NotI.

После введения векторных конструкций в эмбрионы D.melanogaster по экспрессии гена, слитого с последовательностями регуляторных областей элементов группы gypsy, можно будет судить о специфике генетического контроля активности исследуемых элементов. В приложении 1 представлены схемы полученных конструкций.

Применение подобных конструкций позволит проследить динамику активности ретроэлементов на разных стадиях эмбрионального развития и всего жизненного цикла D.melanogaster на одних и тех же трансгенных особях, что невозможно при использовании других методов изучения активности элементов. При этом станет возможным проведение анализа тканеспецифичности экспрессии ретротранспозонов группы gypsy и получение комплексных данных об их активности, измеряя уровень флуоресценции белка GFP, кодируемого репортерным геном и уровень транскрипции репортерного гена. Измеряя экспрессию репортерного гена, мы сможем исключить ограничения обычного количественного ПЦР, проводимого на основе транскриптов ретротранспозонов, поскольку исключается неспецифика, получаемая от транскриптов нефункциональных копий.

Особый интерес будут представлять трансгенные линии, полученные в результате инъекций конструкций в линии с фенотипом flamenco.

Поскольку в линиях с фенотипом flamenco наблюдается повышенная активность ретротранспозонов группы gypsy, будет полезным сравнить то, каким образом проявят себя конструкции в мутантной линии и линии дикого типа.

В данной работе мы применяли конструкции в качестве матрицы для амплификации регуляторных областей ретроэлементов. Таким образом мы исключали появление неспецифичных продуктов, получаемых при ПЦР с геномной ДНК. Мы решили установить возможность связывания белка HP1a с регуляторными последовательностями элементов in vitro.

III.4.2.3. Гель-шифт анализ

По литературным данным известно, что белки семейства НР1 способны связываться с нетранслируемыми областями некоторых транспозонов, таким образом подавляя их транспозицию [Minervini et al., 2007]. Поскольку элементы группы gypsy делятся на три подгруппы по специфичности интеграции [Нефедова, 2007], мы решили выяснить, различаются ли подгруппы по способности связываться с белком HP1a.

Для этого нами были поставлены эксперименты по связыванию HP1а с ДНК элементов in vitro.

В качестве матрицы для связывания мы использовали амплификаты, содержащие 5'UTR области элементов ZAM, tirant, 17,6, rover, gypsy и Springer, полученные на матрице наших конструкций pCasper:LTR-UTREGFP, во избежание связывания неспецифики.

Перед постановкой основных экспериментов методом EMSA, мы провели ряд контрольных экспериментов для того, чтобы подобрать необходимые для связывания условия. В качестве контрольной матрицы мы использовали амплификат гена Grp. В результате установлено, что при низкой ионной силе раствора для связывания HP1a способен связываться практически с любой ДНК-матрицей в большей или меньшей степени.

Поэтому мы повышали концентрацию KСl до тех пор, пока не добились специфичности связывания. Установлено, что при концентрации KСl от 300 до 500 mM связывание с белком HP1a было наиболее специфичным (рис. 19.А). В дальнейших экспериментах по связыванию мы использовали концентрацию 500 mM.

Рис. 19. Контрольные опыты по связыванию ДНК-матрицы с белком HP1a. А. Связывание с нетранслируемой областью элемента tirant (3 полиморфных варианта) и амплификатом гена Grp при разных концентрациях KCl (300, 400, 500 mM). К — контрольная проба без добавления белка. M – 1 kb ladder plus. Б. Связывание с нетранслируемой областью элемента ZAM (3 полиморфных варианта). Присутствуют пробы: белок HP1a без добавления ДНК-матрицы, ДНКматрица без добавления белка, HP1a с ДНК-матрицей, HP1a с ДНК-матрицей в присутствии 10%SDS, белок BSA с ДНК-матрицей.

Мы также убедились, что в нашем образце белка нет чужеродной матрицы, проведя ДНК электрофорез в полиакриламидном геле с пробой белка HP1a. Помимо этого, мы убедились, что подобранные условия для связывания не влияют на связывающую способность других белков.

Добавление 10%-ного SDS, обычно нарушающего образование ДНКбелковых комплексов, в буфер для связывания также не влияло на связывающую способность белка HP1a (рис.19, Б).

Мы начали с постановки эксперимента по связыванию с элементами подгруппы ZAM. Помимо целевых фрагментов в общую смесь для связывания добавлялся «холодный конкурент» - ПЦР фрагмент, с которым не должны образовываться ДНК-белковые комплексы. «Холодный конкурент» выступает дополнительным контролем, подтверждающим, что Рис. 20. Связывание белка HP1a с элементами ZAM и tirant. Красными стрелками обозначены ДНК-белковые комплексы. В качестве контрольного ПЦРфрагмента («холодного конкурента») использовался амплификат гена Grp.

Цифрами обозначено количество белка взятого на пробу в мкг. Красными стрелками обозначены ДНК-белковые комплексы.

наш белок связывается специфически, игнорируя «холодного конкурента»

в качестве матрицы для связывания.

В случае элементов ZAM и tirant белок HP1a в различных разведениях предпочтительнее связывался с копиями элементов, содержащих наибольшее количество повторов (рис. 20).

Это подтверждается и другими экспериментами. При связывании малого количества белка HP1a с амплифицированными областями 5'UTR элемента ДНК-белковые комплексы образовывались с tirant, нетранслируемыми областями, содержащими 6 повторов (рис.21, а). Если мы убирали из общей смеси фрагмент, содержащий 6 повторов, связывание Рис. 21. Связывание белка HP1a с различными полиморфными формами 5'UTR элемента tirant. а - 6 полиморфных вариантов, б - 5 полиморфных вариантов, в — 4 полиморфных варианта, г — 3 полиморфных варианта. Цифрами обозначено число повторов в амплификатах 5'UTR.Черными стрелками обозначены несвязавшиеся с HP1a амплификаты. Красными стрелками обозначены ДНК-белковые комплексы.

и образование ДНК-белковых комплексов происходило с амплификатами имеющими 4 или 5 повторов (рис. 21, б). Похожая картина наблюдалась при удалении из смеси фрагмента с 5-ю повторами (рис.21, в). Интересно, что при тех же концентрациях HP1a и отсутствии амплификатов с 4, 5 и 6 повторами, связывания с оставшимися амплификатами (1-3 повторами) не происходило (рис.21, г).

рис. 22. Связывание белка HP1a с различными полиморфными формами 5'UTR элемента ZAM. Связывание с полиморфными формами нетранслируемой области ZAM (а - с двумя вариантами нетранслируемой области ZAM, содержащими 3 повтора и 1 повтор, б - с двумя вариантами нетранслируемой области ZAM, содержащими 2 повтора и 1 повтор, в - с двумя вариантами нетранслируемой области ZAM, содержащими 3 повтора и 2 повтора). Цифрами обозначено число повторов в амплификатах 5'UTR элементов. Черными стрелками обозначены не связавшиеся с HP1a амплификаты. Красными стрелками обозначены ДНК-белковые комплексы (цифрой 1 обозначено число повторов в смещенном амплификате) В качестве контрольного ПЦР-фрагмента («холодного конкурента») использовали амплификат гена Grp.

Подобная картина наблюдалась и с элементом ZAM. Мы делали разные комбинации c амплификатами, содержащими от 1 до 3 повторов в нетранслируемой области ZAM. Во всех трех экспериментах HP1a связывался полностью с фрагментами, имеющими 2 и 3 повтора (рис.22, а, б, в). Амплификаты с одним повтором связывались слабее, что мы и наблюдали на электрофореграмме - небольшое смещение ПЦР-продукта (рис. 22, а, б).

–  –  –

Рис.23.Связывание белка HP1a с элементами gypsy, Springer, rover и 17,6.

Красными стрелками обозначены ДНК-белковые комплексы. В качестве контрольного ПЦР фрагмента («холодного конкурента») использовался амплификат гена Grp.

–  –  –

В данной работе мы провели комплексный анализ линии SS с целью выяснения причин фенотипа flamenco, характеризуемого повышенной частотой транспозиции МГЭ gypsy.

Основными механизмами регуляции транспозиции МГЭ у D.melanogaster являются РНК-интерференция и механизмы компактизации участков с копиями МГЭ, задействующие белки семейства HP1. Нами установлено, что в линии имеется нарушение в системе SS процессирования малых РНК, необходимых для сайленсинга ретроэлементов. Точную причину нарушения установить трудно.

Накопление транскриптов локуса flamenco можно объяснить мутацией самого локуса или нарушением работы генов системы РНКинтерференции. Скорее всего, первичный транскрипт локуса flamenco после сплайсинга не связывается с факторами, инициирующими его дальнейшее процессирование на малые РНК. Нам удалось исключить мутации, влияющие на транскрипцию, в основных генах, задействованных в piРНК-пути регуляции ретротранспозонов. В дальнейшем будет необходимо провести анализ и других генов, ассоциированных с процессом биогенеза piРНК на стадии обработки первичного транскрипта.

Корреляция в снижении уровня транскрипции hp1d и flamenco, которую мы наблюдали в яичниках линии SS, можно объяснить взаимодействием этих генов. Возможно, как и в другом описанном случае, hp1d(rhino) инициирует транскрипцию кластера piРНК, в данном случае — flamenco. С другой стороны, наблюдаемая корреляция могла быть случайна. Тогда можно предположить, что в линии SS фенотип flamenco формируется комплексно, то есть в результате нарушения работы обоих генов.

Мы также установили, что белок HP1a способен связываться с нетранслируемыми областями элементов группы gypsy. В дальнейшем необходимо сравнить связывающую способность других белков семейства HP1.

Полезным инструментом в изучении механизмов транспозиции могут стать генетические конструкции, содержащие ДКП и нетранслируемые области ретротранспозонов, слитые с репортерными генами. Такие конструкции помогут отследить транспозиционную активность элементов in vivo.

ВЫВОДЫ

Уровни экспрессии генов, участвующих в системах РНКинтерференции, aub, ago-3, zuc, piwi не отличаются в линиях SS и дикого типа. Это свидетельствует о том, что в линии SS эти гены не несут мутаций и, следовательно, не участвуют в формировании фенотипа flamenco.

Показано, что в линии SS, несущей мутацию в локусе flamenco, 2.

сплайсинг РНК, считываемой с этого локуса, не нарушен. Однако содержание сплайсированных транскриптов flamenco в линии SS выше, чем в линии дикого типа, что свидетельствует о нарушениях дальнейших этапов их процессинга.

Анализ экспрессии генов hp1a, hp1b, hp1c, hp1d и hp1е, 3.

кодирующих белки семейства НР1, показал, что hp1d экспрессируется на низком уровне в линии SS. Это указывает на то, что ген hp1d может участвовать в регуляции транспозиции элементов группы gypsy, внося вклад в формирование фенотипа flamenco.

–  –  –

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Медведев Н.Н. Практическая генетика// 1968. 2 изд.

2. Лавренов А.Р., Нефедова Л.Н., Романова Н.И., Ким А.И.. Экспрессия генов семейства hp1 и их возможная роль в формировании фенотипа flamenco у D. melanogaster// Биохимия. 2014. 79(11):1554 –1560.

3. Нефедова Л.Н., Ким А.И. Эволюция эррантивирусов Drosophila melanogaster: от ретротранспозонов к ретровирусам// ЖОБ.2007

4. Урусов, Ф. А., Нефедова, Л. Н., Лавренов, А. Р., Романова, Н. И., Ким, А. И.. Генетический и молекулярный анализ комплементации локусов flamenco и piwi., // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. 381– 389.

5. Abel J., Eskeland R., Raffa G., Kremmer E.& Imhof A. Drosophila HP1C is regulated by an autoregulatory feedback loop through its binding partner Woc.

//PLoS ONE, 2009, 4: e5089.

6. Abrahante, J.E., Daul, A.L., Li, M., Volk, M.L., Tennessen, J.M., Miller, E.A., and Rougvie, A.E. The Caenorhabditis elegans hunch- back-like gene linhbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. //Dev.

Cell 2003, 4, 625–637.

7. Aravin, A.A., M. Lagos-Quintana, A. Yalcin, M. Zavolan, D. Marks, B.

Snyder, T. Gaasterland, J. Meyer, and T. Tuschl. The small RNA profile during Drosophila melanogaster development. //Dev. Cell. 2003. 5:337–350.

8. Aravin, A., D. Gaidatzis, S. Pfeffer, M. Lagos-Quintana, P. Landgraf, N.

Iovino,P. Morris, M.J. Brownstein, S. Kuramochi-Miyagawa, T. Nakano, et al. A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes. // Nature. 2006.

442:203–207.

9. Badugu, R., Yoo, Y., Singh, P.& Kellum, R. Mutations in the heterochromatin protein 1 (HP1) hinge domain affect HP1 protein interactions and chromosomal distribution. // Chromosoma, 2005, 113: 370-384.

10. Baldrich E., Dimitri P., Desset S., Leblanc P., Codipietro D., Vaury C. Genomic distribution of the retrovirus-like element ZAM in Drosophila. // Genetica. 1997;100(1-3):131-40.

11. Bannert, N.& Kurth, R. Retroelements and the human genome:

New perspectives on an old relation. //PNAS, 2004, 101: 14572-14579.

12. Bannister, A., Zegerman, P., Partridge, J., Miska, E.& Thomas, J.

Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. //Nature, 2001, 410:120-124.

13. Basquin, D., Spierer, A., Begeot, F., Koryakov, D. E., Todeschini, A.-L., Ronsseray, S., Delattre, M.. The Drosophila Su(var)3-7 gene is required for oogenesis and female fertility, genetically interacts with piwi and aubergine, but impacts only weakly transposon silencing. // PloS One, 2014 9(5),

14. Brierley, C. and Flavell, A.J. The retrotransposon copia controls the relative levels of its gene products post-transcriptionally by differential expression from its two major mRNAs. // Nucleic Acids Res. 1990. 18: 2947–

15. Brennecke, J., A.A. Aravin, A. Stark, M. Dus, M. Kellis, R.

Sachidanandam, and G.J. Hannon. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. // Cell. 2007. 128:1089–1103.

16. Brennecke, J., Hipfner, D.R., Stark, A., Russell, R.B., and Cohen, S.M. bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila. //Cell.

2003.113, 25–36.

17. Brennecke, J., C.D. Malone, A.A. Aravin, R. Sachidanandam, A.

Stark, and G.J. Hannon. An epigenetic role for maternally inherited piRNAs in transposon silencing. //Science. 2008. 322:1387-92.

18. Brower-Toland, B., Findley, S., Jiang, L., Liu, L.& Yin, H.2007 Drosophila PIWI associates with chromatin and interacts directly with HP1a.

//Genes Development, 2007, 21: 2300-2311.

19. Blumenstiel, J.P. and D.L. Hartl.. Evidence for maternally transmitted small interferingRNA in the repression of transposition in Drosophila virilis. //Proc Natl Acad Sci U S A. 2005. 102: 15965-70.

20. Coffin, J., Hughes, S.& Varmus, H. Retroviruses. //Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997.

21. Conte, C., Dastugue, B.& Vaury, C. Coupling of Enhancer and Insulator Properties Identified in Two Retrotransposons Modulates Their Mutagenic Impact on Nearby Genes. // Molecular and Cellular Biology, 2002, 22: 1767-1777.

22. Cordaux, R.& Batzer, M. The impact of retrotransposons on human genome evolution. //Nature Reviews Genetics, 2009, 10: 691-703.

23. Coustham, V., Bedet, C., Monier, K., Schott, S., Karali, M.& Palladino, F. The C. elegans HP1 homologue HPL-2 and the LIN-13 zinc finger protein form a complex implicated in vulval development. //Developmental Biology, 2006, 297: 308-322.

24. Crittenden, L., Salter, D.& Federspiel, M. Segregation, viral phenotype, and proviral structure of 23 avian leukosis virus inserts in the germ line of chickens. // Theoretical and Applied Genetics, 1989, 77: 505-515.

25. Dennis, C., Zanni, V., Brasset, E., Eymery, A., Zhang, L., Mteirek, R., … Vaury, C.. Dot COM, a nuclear transit center for the primary piRNA pathway in Drosophila. //PloS One, 2013, 8(9) 26. Desset, S., Meignin, C., Dastugue, B., & Vaury, C. COM, a heterochromatic locus governing the control of independent endogenous retroviruses from Drosophila melanogaster. // Genetics. 2003., 164(2), 501–9.

27. Ding, S.-W.& Voinnet, O. Antiviral Immunity Directed by Small RNAs. // Cell. 2007. 130: 413–426.

28. Dohke, K., Miyazaki, S., Tanaka, K., Urano, T., Grewal, S.& Murakami, Y. Fission yeast chromatin assembly factor 1 assists in the

replication-coupled maintenance of heterochromatin. //Genes Cells. 2008. 13:

1027-1043.

29. Dunn, C., Romanish, M., Gutierrez, L., van de Lagemaat, L.& Mager, D. Transcription of two human genes from a bidirectional endogenous retrovirus promoter// Gene, 2006. V. 366.

30. Eissenberg, J.& Hartnett, T. A heat shock–activated cDNA rescues the recessive lethality of mutations in the heterochromatin-associated protein HP1 of Drosophila melanogaster. //Mol. Gen. Genet., 1993, 240: 333-338.

31. Fablet M., McDonald J.F., Bieґmont C., Vieira C. Ongoing loss of the tirant transposable element in naturalpopulations of Drosophila simulans.

//Gene, 2009, 375: 54–62 32. Fanti, L.& Pimpinelli, S. HP1: a functionally multifaceted protein.

//Curr. Opin. Genet. Dev., 2008, 18: 169-174.

33. Fanti, L., Giovinazzo, G., Berloco, M.& Pimpinelli, S. The heterochromatin protein 1 prevents telomere fusions in Drosophila. //Mol. Cell, 1998, 2: 527-538.

34. Font-Burgada, J., Rossell, D., Auer, H.& Azorin, F. Drosophila HP1c isoform interacts with the zinc-finger proteins WOC and relative-of-WOC to regulate gene expression. //Genes Development, 2008, 22: 3007-3023.

35. Fritz, J. Nod-like proteins in immunity, inflammation and disease. // Nature Immunology, 2006, 7: 1250 - 1257.

36. Gillespie, D.& Berg, C. Homeless is required for RNA localization in Drosophila oogenesis and encodes a new member of the DE-H family of RNA-dependent ATPases. //Genes Development, 1995, 9: 2495–5208.

37. Goriaux, C., Desset, S., Renaud, Y., Vaury, C., & Brasset, E..

Transcriptional properties and splicing of the flamenco piRNA cluster. // EMBO Reports, 2014. 15(4), 411–8.

38. Greil, F., van der Kraan, I., Delrow, J., Smothers, J., de Wit, E., Bussemaker, H. et al. Distinct HP1 and Su(var)3-9 complexes bind to sets of developmentally coexpressed genes depending on chromosomal location. // Genes Development, 2003, 22: 2825–2838.

39. Grewal, S.& Elgin, S. Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure. //Curr. Opin. Genet. Dev., 2002, 12: 178-187.

40. Gunawardane, L.S., K. Saito, K.M. Nishida, K. Miyoshi, Y.

Kawamura, T. Nagami, H. Siomi, and M.C. Siomi. A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5’ end formation in Drosophila. //Science. 2007.

315:1587–1590.

41. Handler, D., Meixner, K., Pizka, M., Lauss, K., Schmied, C., Gruber, F. S., & Brennecke, J. The genetic makeup of the Drosophila piRNA pathway. //Molecular Cell, 2013. 50(5), 762–77.

42. Hansen L. J., Chalker D. L., Orlinsky K. J., Sandmeeyer S. B. Ty3 GAG3 and POL genes encode the components of intracellular particles. //J.

Virol., 1992, V. 66, P. 1414-1424.

43. Havecker, E., Gao, X.& Voytas, D. The diversity of LTR retrotransposons. //Genome Biology. 2004. 5: 225.

44. Honda, S.& Selker, E. Direct interaction between DNA methyltransferase DIM-2 and HP1 is required for DNA methylation in Neurospora crassa. // Mol. Cell Biol., 2008. 28: 6044–6055.

45. Horwich, M.D., C. Li, C. Matranga, V. Vagin, G. Farley, P. Wang, and P.D. Zamore. The Drosophila RNA methyltransferase, DmHen1, modifies germline piRNAs and single-stranded siRNAs in RISC. //Curr. Biol. 2007.

17:1265–1272.

46. Huszar T.& Imler J.-L. Chapter 6 Drosophila Viruses and the Study of Antiviral HostDefense. // Advances in Virus Research, 2008, V. 72: 227–265.

47. Humphreys D.T., B.J. Westman D.I. Martin, and T. Preiss.

MicroRNAs controltranslation initiation by inhibiting eukaryotic initiation

factor 4E/cap and poly(A) tail function. // Proc Natl Acad Sci U S A 2005. 102:

16961-6

48. Ipsaro J.J., Haase A.D., Knott S.R., JoshuaTor L., Hannon G.J. The structural biochemistry of Zucchini implicates it as a nuclease in piRNA biogenesis. //Nature 2012. 491: 279–283.

49. Ishizu H., Siomi H., & Siomi M. C.. Biology of PIWI-interacting RNAs: new insights into biogenesis and function inside and outside of germlines. // Genes & Development, 2012. V. 26(21), 2361–73.

50. Jacobs, S.& Khorasanizadeh, S. Structure of HP1 chromodomain bound to a lysine 9–methylated histone H3 tail. // Science, 2002, 295: 2080Jaenisch, R. Germ line integration and Mendelian transmission of the exogenous Moloney leukemia virus. // PNAS, 1976, 73: 1260–1264.

52. Jaenisch, R., Jhner, D., Nobis, P., Simon, I., Lhler, J., Harbers, K.

et al. Chromosomal position and activation of retroviral genomes inserted into the germ line of mice. // Cell, 1981, 24: 519–529.

53. James, T.& Elgin, S. Identification of a nonhistone chromosomal protein associated with heterochromatin in Drosophilamelanogaster and its gene. // Mol. Cell Biol., 1986, 6: 3862–3872.

54. Jern, P.& Coffin, J. Effects of Retroviruses on Host Genome Function. // Annual Review of Genetics, 2008, 42: 709–732.

55. Jordan, I.& McDonald, J. Evidence for the Role of Recombination in the Regulatory Evolution of Saccharomyces cerevisiae Ty Elements. // Journal of molecular evolution, 1998, 47: 14–20.

56. Jurka, J., Kohany, O., Pavlicek, A., Kapitonov, V.& Jurka, M.

Clustering, duplication and chromosomal distribution of mouse SINE retrotransposons. // Cytogenet Genome Res, 2005, 110: 117–123.

57. Kellum R, Alberts BM Heterochromatin protein 1 is required for correct chromosome segregation in Drosophila embryos. // J Cell Sci. 1995.

108(Pt 4), 1419-1431.

58. Kim, A., Belyaeva, E.& Aslanian, M. Autonomous transposition of gypsy mobile elements and genetic instability in Drosophilamelanogaster. // Molecular Genetics and Genomics, 1990, 224: 303-308.

59. Kim, A., Lyubomirskaya, N., Belyaeva, E., Shostack, N.& Ilyin, Y.

The introduction of a transpositionally active copy of retrotransposon GYPSY into the Stable Strain of Drosophilamelanogaster causes genetic instability.

//Molecular Genetics and Genomics, 1994, 242: 472~477.

Kim, a, Terzian, C., Santamaria, P., Plisson, a, Purd’homme, N., & 60.

Bucheton, a. (1994). Retroviruses in invertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91(4), 1285– 9.

61. Klattenhoff, C., Xi, H., Li, C., Lee, S.& Xu, J. The Drosophila HP1 homologue Rhino is the piRNA pathway. required for transposon silencing and piRNA production by dual strand clusters. //Cell, 2009.

62. Kwon, S. H., & Workman, J. L.. HP1c casts light on dark matter.

//Cell Cycle. 2011a, 10(4), 625–630.

63. Kwon, S. H., & Workman, J. L.. The changing faces of HP1: From

heterochromatin formation and gene silencing to euchromatic gene expression:

HP1 acts as a positive regulator of transcription. // BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology, 2011b. 33(4), 280– 9.

Lachner, M., O’Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K.& Jenuwein, T.

64.

Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 protein. // Nature, 2001, 410: 116-120.

65. Le Thomas A, Rogers AK, Webster A, Marinov GK, Liao SE, Perkins EM, Hur JK, Aravin AA, Toth KF Piwi induces piRNA-guided transcriptional silencing and establishment of a repressive chromatin state. //Genes Dev 2013. 27: 390–399 66. Leblanc P., Desset S., Dastugue B., Vaury C. Invertebrate retroviruses: ZAM a new candidate in D.melanogaster. // EMBO J., 1997, 16:7521-31.

67. Lee, D. H., Li, Y., Shin, D.-H., Yi, S. A., Bang, S.-Y., Park, E. K., … Kwon, S. H. DNA microarray profiling of genes differentially regulated by three heterochromatin protein 1 (HP1) homologs in Drosophila. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2013. 434(4), 820–828.

68. Lee Y. S., Nakahara K., Pham J. W., Kim K., He Z., Sontheimer E.

J., and Carthew*R. W. Distinct Roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA Silencing Pathways. //Cell, April 2, 2004. 117. 69–81, 69. Levine MT, McCoy C, Vermaak D, Lee YCG Phylogenomic Analysis Reveals Dynamic Evolutionary History of the Drosophila

Heterochromatin Protein 1 (HP1) Gene Family. // PLoS Genetics, 2012, 8:

e1002729.

70. Li, C., V.V. Vagin, S. Lee, J. Xu, S. Ma, H. Xi, H. Seitz, M.D.

Horwich, M. Syrzycka, B.M. Honda, et al. Collapse of germline piRNAs in the absence of Argonaute3 reveals somatic piRNAs in flies. // Cell. 2009.137:509–

521. doi:10.1016/j.cell.2009.04.027 71. Lin, S.Y., Johnson, S.M., Abraham, M., Vella, M.C., Pasquinelli, A.

Gamberi, C., Gottlieb, E., and Slack, F.J. (2003). The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Dev. Cell 4, 639–650.

72. Liu, Q., Rand, T.A., Kalidas, S., Du, F., Kim, H.E., Smith, D.P., and Wang, X. R2D2, a bridge between the initiation and effector steps of the Drosophila RNAi pathway. // Science. 2003. 301, 1921–1925.

73. Lippman, Z., & Martienssen, R. (2004). The role of RNA interference in heterochromatic silencing. // Nature, 431(7006), 364–70.

74. Llave, C., Xie, Z., Kasschau, K.D., and Carrington, J.C. (2002).

Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA. // Science 297, 2053–2056.

75. Malone, C.D., and G.J. Hannon. 2009. Small RNAs as guardians of the genome. // Cell. 136:656–668. doi:10.1016/j.cell.2009.01.045

76. Malone, C.D., J. Brennecke, M. Dus, A. Stark, W.R. McCombie, R.

Sachidanandam, and G.J. Hannon. 2009. Specialized piRNA pathways act in germline and somatic tissues of the Drosophila ovary. //Cell.137:522–535.

77. Mvel-Ninio, M., Pelisson, A., Kinder, J., Campos, A.& Bucheton, A. The flamenco Locus Controls the gypsy and ZAM Retroviruses and Is Required for Drosophila Oogenesis. // Genetics, 2007, 175: 1615-1624.

78. Marques, J.& Carthew, R. A call to arms: coevolution of animal

viruses and host innate immune responses. // TRENDS in Genetics, 2007, 23:

359-364.

79. Martin, S. Nucleic acid chaperone properties of ORF1p from the non-LTR retrotransposon, LINE-1. // RNA Biology, 2010, 7: 706-711.

80. McDonald, J., Matyunina, L., Wilson, S., King Jordan, I., Bowen, N.& Miller, W. LTR retrotransposons and the evolution of eukaryotic enhancers.

// Genetics and Evolution, 1997, 6: 3-13.

81. Meehan, R., Kao, C.& Pennings, S. HP1 binding to native chromatin in vitro is determined by the hinge region and not by the chromodomain // EMBO. 2003. 22: 3164–3174.

82. Meignin, C., Bailly, J.-L., Arnaud, F., Dastugue, B.& Vaury, C. The 5 Untranslated Region and Gag product of Idefix, a Long Terminal RepeatRetrotransposon from Drosophila melanogaster, Act Together To Initiate a Switch between Translated and Untranslated States of the Genomic mRNA // Molecular and Cellular Biology. 2003. 23: 8246-8254.

83. Minervini, C., Marsano, R., Casieri, P., Fanti, L., Caizzi, R., Pimpinelli, S. et al. Heterochromatin protein 1 interacts with 5UTR of transposable element ZAM in a sequence-specific fashion // Gene. 2007. 393: 1– 10.

84. Moshkovich, N., & Lei, E. P. HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila // PLoS Genetics. 2010. 6(3)

85. Mugnier, N., Bimont, C.& Vieira, C. New Regulatory Regions of Drosophila 412 Retrotransposable Element Generated by Recombination // Molecular biology and evolution. 2005. 22: 747-757.

86. Nabirochkin, S., Ossokina, M., Heidmann, T.A Nuclear Matrix/Scaffold Attachment Region Co-localizes with the Gypsy Retrotransposon Insulator Sequence // Journal of Biological Chemistry. 1998.

273: 2473-2479.

87. Nakayama, J., Rice, J., Strahl, B., Allis, C.& Grewal, S. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly// Science. 2001. 292: 110-113.

88. Nefedova, L.N., Romanova, N.I., Kim A.I. Structural characterization of the DIP1 gene in Drosophila melanogaster strains mutant for the flamenco gene// Genetica. 2007. 43: 70-77

89. Nefedova, L.N., Potapova, M.V., Romanova, N.I., Kim A.I. Analisis of the structure and expression of the DIP 1 gene gene in Drosophila melanogaster strains mutant for the flamenco gene// Genetica. 2009. 45: 203Nefedova, L.N. & Kim, A.I. Molecular Phylogeny and Systematics

of Drosophila Retrotransposons and Retroviruses// Molecular Biology. 2009. 43:

747–756 91. Nishimasu H, Ishizu H, Saito K, Fukuhara S, Kamatani MK, Bonne fond L,Matsumoto N, Nishizawa T, Nakanaga K, Aoki J, et al. Structure and function of Zucchini endoribonuclease in piRNA biogenesis// Nature. 2012.

491:284–287.

92. Olovnikov, I. A., Adyanova, Z. V., Galimov, E. R., Andreev, D. E., Terenin, I. M., Ivanov, D. S., Dmitriev, S. E. Key role of the internal 5-UTR segment in the transcription activity of the human L1 retrotransposon// Molecular Biology// 2007. 41(3), 453–458.

93. Palatnik, J.F., Allen, E., Wu, X., Schommer, C., Schwab, R., Carrington, J.C., and Weigel, D. Control of leaf morphogenesis by microRNAs// Nature. 2003. 425: 257–263.

94. Plisson, A., Emeline Sarot, E., Payen-Groschne, G.& Bucheton, A. A Novel Repeat-Associated Small Interfering RNA-Mediated Silencing Pathway Downregulates Complementary Sense gypsy Transcripts in Somatic Cells of the Drosophila Ovary// Journal of Virology. 2007. 81: 1951-1960.

95. Perrini, B., Piacentini, L., Fanti, L., Altieri, F., Chichiarelli, S., Berloco, M. et al. HP1 controls telomere capping, telomere elongation, and telomere silencing by two different mechanisms in Drosophila// Mol Cell. 2004.

15: 467-76.

96. Pham, J.W., Pellino, J.L., Lee, Y.S., Carthew, R.W., and Sontheimer, E.J. (2004). A Dicer-2-dependent 80S complex cleaves targeted mRNAs during RNAi in Drosophila // Cell. 117: 83–94.

97. Potapova, M.V., Nefedova, L.N. & Kim, A.I. Analysis of the structure and expression of the claster of the Drosophila melanogaster genes DIP1, CG32500, CG32819, CG14476 in the flamenco gene region// Genetica.

2009. 45: 1324-1331 Prud’homme, S., Oriol, G.& Mallet, F. A Retroviral Promoter and a 98.

Cellular Enhancer Define a Bipartite Element Which Controls env ERVWE1 Placental Expression// Journal of Virology. 2004. 78: 12157-12168.

99. Reinhart, B.J., Slack, F.J., Basson, M., Pasquinelli, A.E., Bettinger, J.C., Rougvie, A.E., Horvitz, H.R., and Ruvkun, G. The 21-nt let-7 RNA regulates developmental timing in C. elegans// Nature. 2000. 403: 901–906

100. Robert, V., Prud'homme, N., Kim, A., et al. Characterisation of the

flamenco region of the Drosophila melanogaster genome// Genetics. 2001. 158:

701-713

101. Rozhkov NV, Hammell M, Hannon GJ 2013. Multiple roles for Piwi in silencing Drosophila transposons// Genes Dev. 27: 400–412

102. Sackton, T.& Hartl, D. Meta-analysis reveals that genes regulated by the Y chromosome in Drosophila melanogaster are preferentially localized to repressive chromatin// Genome Biol Evol. 2013. 5: 255-266.

103. Saito, K., K.M. Nishida, T. Mori, Y. Kawamura, K. Miyoshi, T.

Nagami, H. Siomi, and M.C. Siomi. Specific association of Piwi with rasiRNAs derived from retrotransposon and heterochromatic regions in the Drosophila genome// Genes Dev. 2006. 20:2214–2222.

104. Saito K, Ishizu H, Komai M, Kotani H, Kawamura Y, Nishida KM, Siomi H, Siomi MC Roles for the Yb body components Armitage and Yb in primary piRNA biogenesis in Drosophila// Genes Dev. 2010. 24: 2493–2498

105. Sarot, E., G. Payen-Groschene, A. Bucheton, and A. Pelisson.

Evidence for a piwi dependent RNA silencing of the gypsy endogenous

retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene// Genetics. 2004. 166:

1313-21.

106. Schwartzberg, P. The many faces of Src: multiple functions of a prototypical tyrosine kinase// Oncogene. 1998. 17: 1463-1468.

–  –  –

108. Shiba T., Seigo K. Retrovirus-like particles containing RNA homologous to the transposable element copia in D. melanogaster //Nature.

1983. 302: 119-124.

109. Sienski G, Donertas D, Brennecke J Transcriptional silencing of transposons by Piwi and maelstrom and its impact on chromatin state and gene expression// Cell. 2012.151: 964–980

110. Smallwood, A., Esteve, P., Pradhan, S.& Carey, M. Functional cooperation between HP1and DNMT1 mediates gene silencing// Genes Development. 2007. 21: 1169–1178.

111. Smothers, J.& Henikoff, S. The hinge and chromo shadow domain impart distinct targeting of HP1-like proteins// Mol. Cell Biol. 2001. 21: 2555– 2569.

112. Smothers, J.& Henikoff, S. The HP1 chromo shadow domain binds a consensus peptide pentamer//Current Biology. 2000. 10: 27-30.

113. Song, S. U., Gerasimova, T., Kurkulos, M., Boeke, J. D., Corces, V.

G. An env-like protein encoded by a Drosophila retroelement: evidence that gypsy is an infectious retrovirus// Genes Dev. 1994. 8: 2046–2057.

114. Syomin BV, Kandror KV, Semakin AB, Tsuprun VL, Stepanov AS Presence of the gypsy (MDG4) retrotransposon in extracellular virus-like particles//FEBS Lett. 1993. 323: 285–288.

115. Talbert, P., LeCiel, C.& Henikoff, S. Modification of the Drosophila heterochromatic mutation Brown (dominant) by linkage alterations// Genetics. 1994. 136: 559-571.

116. Tcheressiz S., Calco V., Arnaud F. et al. Expression of the Idefix retrotransposon in early follicle cells in thegermarium of Drosophila melanogaster is determined by its LTR sequences and a specific genomic context// Mol. Genet. Genomics. 2002. 267: 133–141.

117. Thomas, J.& Schneider, S. Coevolution of retroelements and tandem zinc finger genes// Genome research. 2011. 11: 1800-1812.

118. Van de Lagemaat, L., Landry, J.-R., Mager1, D.& Medstrand, P.

Transposable elements in mammals promote regulatory variation and diversification of genes with specialized functions// Trends in Genetics. 2003.

19: 30-36.

119. Vaury, C., A. Bucheton and A. Pelisson. The beta-heterochromatic sequences flanking the I elements are themselves defective transposable elements // Chromosoma. 1989. 98: 215-224.

120. Vermaak, D. & Malik, H. Multiple Roles for Heterochromatin Protein 1 Genes in Drosophila// Annual Review of Genetics.2009. 43: 467-492.

121. Vermaak, D., Henikoff, S., & Malik, H. Positive selection drives the evolution of rhino, a member of the heterochromatin protein 1 family in Drosophila// PLoS Genetetics. 2005. 1: 96-108.

122. Volpe, T., Kidner, C., Hall, I., Teng, G., Grewal, S., & Martienssen, R. Drosophila rhino encodes a femalespecific chromo-domain protein that affects chromosome structure and egg polarity// Genetics. 2001. 159: 1117-1134.

123. Wang SH, Elgin SC 2011. Drosophila Piwi functions downstream of piRNA production mediating a chromatin-based transposon silencing mechanism in female germ line// Proc. Natl. Acad. Sci. 108: 21164–21169

124. Wilson, S., Matyunina, L., & McDonald, J. An enhancer region within the copia untranslated leader contains binding sites for Drosophila regulatory proteins// Gene. 1998. 209: 239-246.

125. Yasuhara, J., & Wakimoto, B. Oxymoron no more: the expanding world of heterochromatic genes// Trends Genet. 2006. 22: 330-338.

126. Yamamoto, M. T., A. Mitchelson, M. Tudor, K. O'Hare, J. A. Davies et al. Molecular and cytogenetic analysis of the heterochromatin-euchromatin junction region of the Drosophila melanogaster X chromosome using cloned DNA sequences// Genetics. 1990. 125: 821-832.

127. Yin, H., and H. Lin. An epigenetic activation role of Piwi and a Piwi associated piRNA in Drosophila melanogaster. // Nature. 2007. 450:304– 308.

128. Zhang, J., & Temin, H. Retrovirus recombination depends on the length of sequence identity and is not error prone //Journal of Virology. 1994.

68: 2409-2414.

129. Zhao, T., Heyduk, T., Allis, C. D., & Eissenberg, J. C..

Heterochromatin protein 1 binds to nucleosomes and DNA in vitro// The Journal of Biological Chemistry 2000. 275(36).

–  –  –

Конструкция pCasper:Springer LTR-UTR+EGFP. Содержит последовательность ДКП элемента Springer и прилегающую к нему нетранслируемую область слитую с репортерным геном EGFP.

–  –  –

Конструкция pCasper:ZAM LTR-UTR+EGFP. Содержит последовательность ДКП элемента ZAM и прилегающую к нему нетранслируемую область слитую с репортерным геном EGFP.

.

Конструкция pCasper:rover LTR-UTR+EGFP. Содержит последовательность ДКП элемента rover и прилегающую к нему нетранслируемую область слитую с репортерным геном EGFP.

Конструкция pCasper:17,6 LTR-UTR+EGFP. Содержит последовательность ДКП элемента 17,6 и прилегающую к нему нетранслируемую область слитую с репортерным геном EGFP.

–  –  –

Конструкция pCasper:gypsy LTR-UTR+EGFP. Содержит последовательность ДКП элемента gypsy и прилегающую к нему нетранслируемую область слитую с репортерным геном EGFP.

–  –  –

Конструкция pCasper:tirant LTR-UTR+EGFP. Содержит последовательность ДКП элемента tirant и прилегающую к нему нетранслируемую область слитую с репортерным геном EGFP.

Благодарности Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю профессору Александру Иннокентьевичу Киму, профессору Борису Александровичу Кузину, доценту Лидии Николаевне Нефедовой, доценту Наталии Ивановне Романовой, ассистенту Илье Владимировичу Кузьмину и всему коллективу лаборатории генетики животных кафедры генетики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.



Похожие работы:

«МЕТОДИКА РАСЧЕТА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГУМАНИТАРНОГО БАЛАНСА БИОТЕХНОСФЕРЫ УРБАНИЗИРОВАНЫХ ТЕРРИТОРИЙ (НА ПРИМЕРЕ Г.О. ВОРОНЕЖ) Баринов В.Н., Щербинин Д.Г., Шамарин Д.С., Шичкин В.В. Воронежский государственный архитектурно-строительный университет Воронеж, Россия METHOD OF CALCULATION OF INDICATORS OF HUMANITARIAN BALANCE OF THE BIOT...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Факультет ветеринарной медицины Рабочая программа дисциплины "ВЕТЕРИНАРНАЯ ЭКОЛОГИЯ" Направление под...»

«Муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение "Центр развития ребенка детский сад №39 "Золотой петушок" г. Альметьевска РТ" Сообщение из опыта работы "Экологическое воспитание детей младшего дошкольного возраста через нар...»

«Куляш Алишева ЭКОЛОГИЯ НШПАМЫ ******I ™ : с Т 0 Г А " ;" * 0 " П Ж "ЯО Д * " ^ ^ Р С И Т С Т ^ ^ I С, БСЙСВМБАКв АТЫМДАГЫ ГЫ ЛЫ МИ К1ТАПЛАН* I ОКУ ' Ч Й *А Л Ь И *#1 •^ ^ г * г * М в А Е В А И НАУЧНАЯ БИБЛИОИСК^ VI, !. С. Ь Ы и ь м | р м ш р а м м а ш м я ^ ‘.4 I (г I V. 1. ( ' и ^АбЧ • П А ВЛО Д А ГС**# I *""* ^ я ‘. —* АЛМАТ...»

«Биологические науки УДК 631.41 А.А. Алексеева, Н.В. Фомина АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ РЕДУЦИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ АГРОГЕННО ИЗМЕНЕННЫХ ПОЧВ ЛЕСНЫХ ПИТОМНИКОВ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ КРАСНОЯРСКОГО КРАЯ В статье представлены результаты изучения редуцирующих ферментов нитрати нитритредуктазы агрогенно измененн...»

«Секция 3: Социально-гуманитарные аспекты экологии Литература.1. Акимов В.А., Соколов Ю.И. Проблемы анализа риска. – 2010. – Т. 7, № 4. – С. 29–33.2. Яковлев С.Ю. Когнитивные модели и технологии обеспечения безопасности разв...»

«ВЕСТНИК СВНЦ ДВО РАН, 2012, № 4, с. 28–37 ГИДРОБИОЛОГИЯ, ИХТИОЛОГИЯ УДК 59(092) РАЗВИТИЕ ИДЕЙ БИОГЕОГРАФИИ, ТАКСОНОМИИ И ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ В РАБОТАХ ЯРОСЛАВА ИГОРЕВИЧА СТАРОБОГАТОВА (1932–2004) Л. А. Прозорова1, В. В. Богатов1, И. А. Черешнев2 Биолого-почвенный институт ДВО РАH, г....»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Кемеровский государственный университет Биологический факультет Рабочая программа дисциплины Иммунология Направление подготовки 06.03.01 Биология Направленность (профиль) подго...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Кемеровский государственный университет Биологический факультет Рабочая программа дисциплины ГЕОКРИОЛОГИЯ Направление подготовки 05.03.01 Геология Направленность (профиль) подготовки Геология Уровень бакалавриата Форма обучения Очная Кемерово 2016 Содержание Содержание 1. Перечень планируемых р...»

«БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ 23 УДК 599.735.51: 577.122 ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА У КОРОВ-ПЕРВОТЕЛОК В ТЕЧЕНИЕ ЛАКТАЦИОННОГО ПЕРИОДА И. В. Котович кандидат биологических наук, доцент, заведующий кафедрой биологии УО "Мозырский государственный педагогический университет им...»

«© 2006 г. Ю.Ф. ФЛОРИНСКАЯ ТРУДОВАЯ МИГРАЦИЯ ИЗ МАЛЫХ РОССИЙСКИХ ГОРОДОВ КАК СПОСОБ ВЫЖИВАНИЯ ФЛОРИНСКАЯ Юлия Фридриховна кандидат географических наук, старший научный сотрудник Центра демогра...»

«А. П. Кудряшов БИОСЕНСОРНЫЕ УСТРОЙСТВА КУРС ЛЕКЦИЙ Минск БГУ У Д К 5 7 4. 6 ( 0 7 5. 8 ) + 5 4 3. 9 ( 0 7 5.8 ) ББК 30.116я73 К88 Рецензенты кандидат биологических наук А.В.Плакс кандидат биологических наук И.В.Семакс Печатается по решению Редакционно-издательского совета Белорусского государств...»

«И.В. Челышева Развитие критического мышления и медиакомпетентности студентов в процессе анализа аудиовизуальных медиатекстов Учебное пособие для педагогических вузов по специальности 03.13.00 "Социальная педагогика", специализации 03.13.30 "Медиаобразование" Таганрог Челышева И.В. Развитие...»

«Бюллетень Никитского ботанического сада. 2011. Вып. 102 ИНВЕНТАРИЗАЦИЯ ДЕНДРОФЛОРЫ ПАРКА ИМ. Т. Г. ШЕВЧЕНКО В ГОРОДЕ СИМФЕРОПОЛЕ Н.В. ПОТЕМКИНА, кандидат биологических наук; Н.П. РОМАНЕНКО Южный филиал "Крымский агротехнологический университет" НУБиП Введение Плановые обследования парковых насаждений, проводимые с интерв...»

«ФГБОУ ВПО "КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" кафедра фитопатологии, энтомологии и защиты растений Посвящается 90-летию Кубанского государственного аграрного университета ЗАМОТАЙЛОВ А.С., ПОПОВ И.Б., БЕЛЫЙ А.И.ЭКОЛОГИЯ НАСЕКОМЫХ электронн...»

«2 1. Аннотация Кандидатский экзамен по специальной дисциплине для аспирантов специальности 03.03.01физиология проводится кафедрой "Физиологии и этологии животных". Общая трудоемкость кандидатского экзамена составляет 1 зачетную единицу, 36 часов самостоятельной работы аспиранта.2. Содержание кандидатского экзамена 1. Общие положения...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ ЗАПОРОЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА ФИЗИЧЕСКОЙ И КОЛЛОИДНОЙ ХИМИИ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ И ВЫПОЛН...»

«Программа дисциплины "Экологическое картографирование" Авторы: доц. Е.А. Божилина, доц. Т.Г. Сваткова, доц. С.В. Чистов Цели освоения дисциплины: представить современные концепции экологического картографирования и научить студентов разрабатывать соответствующие темат...»

«А.А. Ковылин, Д.В. Злобин, А.Ю. Родионов 4. Молекулярно-биологические базы данных // Объединенный центр вычислительной биологии и биоинформатики [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://jcbi.ru/baza/index.shtml, свободный. Яз. рус. (дата обращения 16.05.2012).5. Stoesser G., Baker W., van den Broek A. et al. The EMBL Nucleotide Sequence Da...»

«белорусских городов. Кроме того, были выделены новые опорные центры: Давид-Городок (высокий историко-культурный и религиозный потенциал), Логишин (культурно-познавательный), новый перспективный район развития туризма – Столинско-Ольманский центр (экологический и экстремальный туризм), а также центр водного т...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.