WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 


«БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙРОТОКСИНОВ ТРОПИЧЕСКОЙ АКТИНИИ HETERACTIS CRISPA Кветкина Александра Николаевна студент, Дальневосточный федеральный университет, РФ, г. Владивосток E-mail: ...»

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙРОТОКСИНОВ

ТРОПИЧЕСКОЙ АКТИНИИ HETERACTIS CRISPA

Кветкина Александра Николаевна

студент, Дальневосточный федеральный университет, РФ, г. Владивосток

E-mail: sashaledy.ru@mail.ru

Калина Римма Сергеевна

студент, Дальневосточный федеральный университет, РФ, г. Владивосток

E-mail: kalinarimma@gmail.com

Гладких Ирина Николаевна

канд. хим. наук, н.с. лаборатории химии пептидов, Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук, РФ, г. Владивосток Монастырная Маргарита Михайловна д-р хим. наук, в.н.с. лаборатории химии пептидов, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук, РФ, г. Владивосток Зелепуга Елена Александровна канд. физ.-мат. наук, н.с. лаборатории химии пептидов, Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук, РФ, г. Владивосток Козловская Эмма Павловна д-р хим. наук, профессор, Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук, РФ, г. Владивосток ______________________________

Биологическая активность нейротоксинов тропической актинии Heteractis crispa // Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. Кветкина А.Н. [и др.]. 2014. № 5-6 (6).

URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/1351

BIOLOGICAL ACTIVITY OF HETERACTIS CRISPA NEUROTOXINS

Kvetkina Aleksandra student, Far Eastern Federal University, Russia, Vladivostok Kalina Rimma student, Far Eastern Federal University, Russia, Vladivostok Gladkikh Irina candidate of chemical sciences, research worker of the laboratory of Peptide Chemistry, G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Russia, Vladivostok Monastyrnaya Margarita Doctor of Chemistry, leading research worker of the laboratory of Peptide Chemistry, G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Russia, Vladivostok

–  –  –

АННОТАЦИЯ

Известно, что нейротоксины актиний высоко токсичны для млекопитающих, но для крабов наблюдается обратная закономерность [2].

Проведено выделение нейротоксинов из актинии Heteractis crispa с целью проверки их инсектоксичности и сравнительной оценки с токсичностью на крабах. Показано, что токсичность нейротоксинов на крабах коррелирует с инсектотоксичностью, что может быть использовано в дальнейшем для получения на их основе инсектицидных препаратов.

ABSTRACT

It is known that sea anemone neurotoxins are high-toxic on mammals, while the opposite pattern was observed for crabs. The isolation of neurotoxins from sea anemone Heteractis crispa was conducted for the purpose of verification of their insect toxicity and comparative evaluation with crab toxicity. It has been shown that the crab toxicity of the isolated neurotoxins correlates with their insect toxicity. It can be used for creation of insecticidal agents.

Ключевые слова: инсектотоксичность, RTX-I, RTX-II, RTX-III, актинии, нейротоксины.

Keywords: insect toxicity, RTX-I, RTX-II, RTX-III, sea anemones, neurotoxins.

Актинии — одни из древнейших хищных животных на Земле. Являясь сидячими организмами, эти представители донных биоценозов охотятся на проплывающих мимо мелких рыб, ракообразных и моллюсков, парализуя своих жертв с помощью ядовитого секрета, выпускаемого стрекательными клетками, книдоцитами. Эти клетки находятся в щупальцах и акрорагах, располагающихся вокруг ротового отверстия [14]. Яд актиний представляет собой сложный комплекс биологически активных соединений, включающий токсины белковой природы: нейротоксины, модифицирующие натриевые и калиевые каналы электровозбудимых мембран нервных, скелетных и мышечных клеток; цитолизины — пороформирующие токсины (или актинопорины), вызывающие лизис клеток благодаря формированию пор в цитоплазматических мембранах, и фосфолипазы А2 — непрямые гемолитики, а также протеолитические ферменты и ингибиторы протеиназ [9]. Токсичные компоненты ядов актиний выполняют алломональную и экологическую роль, защищая организм-продуцент от других хищников, служат орудием нападения на потенциальную жертву, необходимую актинии для пропитания, и тем самым определяют экологическую нишу актиний в морском биоценозе.

Наиболее изученными компонентами полипептидной природы актиний являются нейротоксины, которые специфично связываются с потенциалзависимыми Na+- и K+-каналами и замедляют процесс их инактивации. Нейротоксины представляют собой полипептиды, состоящие из 46—48 а.о., молекулярная масса которых составляет около 5 кДа. Молекула нейротоксина стабилизирована 2—3 дисульфидными мостиками. К настоящему времени установлено не менее трех десятков первичных структур нейротоксинов из различных видов актиний [9]. Эти полипептиды токсичны для позвоночных и беспозвоночных, обладают нейротропным и кардиотропным действием.

Перспективным источником нейротоксинов является тропическая актиния Heteractis crispa, из которой ранее было выделено пять индивидуальных нейротоксинов RTX-I — RTX-V, и для каждого определена аминокислотная последовательность (рис. 1) [2]. Они принадлежат к структурному типу 2 так называемых «длинных» анемонотоксинов и проявляют высокую специфичность при связывании с потенциалзависимыми натриевыми каналами (NaV) электровозбудимых мембран [5].

Ранее методом Н1-ЯМР-спектроскопии была определена пространственная структура самого токсичного для млекопитающих анемонотоксина RTX-III.

Методом компьютерного моделирования построена молекулярная модель 3Dструктуры RTX-III (рис. 3). Для вторичной структуры этого нейротоксина характерно наличие четырех антипараллельных -стрендов, гибкой петли, называемой «Arg 14 петля», в состав которой входит остаток Arg, выполняющий роль центра связывания нейротоксина с Na+-каналом, и шести остатков цистеина, которые формируют три дисульфидных связи, стабилизирующие фолд молекулы.

Рисунок 1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей анемонотоксинов 1 и 2 структурных типов: ATX-II и ATX-V (Swiss-Prot, P01528.

1, P01529.1) из Anemonia sulcata, AP-A и AP-B (Swiss-Prot, P01530.1, P01531.1) из Anthopleura xanthogrammica, AP-C (SwissProt, P01532.1) из Anthopleura elegantissima, RTX-I — RTX-V из H. crispa, Sh-I (Swiss-Prot, P19651.1) из Stichodactyla helianthus, Rp-II (Swiss-Prot, P01534.1) из Radianthus paumotensis. На сером фоне показаны идентичные а.о.

в последовательностях анемонотоксинов структурных типов 1 и 2 Рисунок 2. Ленточная диаграмма модели 3D-структуры RTX-III.

Голубым цветом показан гидрофобный регион.

Модель построена с помощью программы RASMOL Ранее путем химической модификации функциональных групп аминокислотных остатков установлено, что в последовательности RTX-III отсутствует остаток, абсолютно необходимый для функциональной активности полипептида [4]. Это не противоречило классической концепции взаимодействия «активного центра» молекулы анемонотоксина (с остатком Arg13 в качестве центра связывания) с Na+-каналом. Было показано, что разрушение дисульфидных связей приводит к полному падению активности RTX-III, связанному с изменением пространственной структуры фолда, а для проявления функциональной активности анемонотоксина важно наличие протонированных карбоксильных и аминогрупп. Результаты изменения активности RTX-III после модификации заряженных а.о. молекулы свидетельствовали о том, что его взаимодействие с потенциалчувствительным Na+- каналом в большей степени определяется электростатическими силами и носит многоточечный характер, при котором блокирование одних функционально важных остатков не мешает токсину связываться с каналом другими функционально значимыми остатками [4]. Согласно данным электрофизиологических исследований, RTX-III замедляет фазу реполяризации потенциала действия мышечных и нервных волокон и, таким образом, частично ингибирует процесс инактивации NaV каналов [1].

Исследования показали, что нейротоксины действуют in vivo как на ракообразных, так и на млекопитающих.

Так, значения летальных доз RTX-I — RTX-V для млекопитающих (мышь) варьируют от 3000 мкг/кг (RTXI) до 25 и 40 мкг/кг (RTX-III и RTX-IV соответственно), в то время как для крабов наблюдалась обратная закономерность [2]. В последнее время появились данные, что яды актиний оказывают токсическое действие и на насекомых. Так, из актинии Bunodosoma granulifera выделено два токсичных для сверчков (Acheta domestica) и личинок мух (Sarcophaga carnaria) пептида, BgII и BgIII (5072 Да и 5073 Да соответственно), которые замедляют процесс инактивации NaV каналов насекомых, что приводит к их гибели [7].

С эволюционной точки зрения не понятно, почему актинии содержат токсины, действующие на насекомых, притом что эти морские кишечнополостные никогда не сталкиваются друг с другом в «повседневной жизни». В последние годы, однако, появились генетические данные, свидетельствующие в пользу более тесного родства насекомых и ракообразных [7]. Обнаружилось, что насекомые представляют собой всего лишь одну из многих филетических линий ракообразных. Таким образом, токсины, действующие на ракообразных, гипотетически могут оказывать эффекты и на насекомых. Следовательно, нейротоксины можно рассматривать как компоненты Heteractis с потенциальным инсектицидным действием.

В данной работе из этанольного экстракта H. crispa по ранее разработанной в лаборатории химии пептидов методике [2] (гидрофобная хроматография на полихроме-1, ионообменная хроматография на Bio-Rex 70 и SP-Sephadex была получена суммарная фракция, содержащая C-25) нейротоксины RTX-I и RTX-II, а также фракция высокоочищенного нейротоксина RTX-III. При тестировании полипептидов обеих фракций in vivo было показано, что они обладают инсектотоксической активностью на личинках мясных мух (в дозе 3,3 мкг/кг и 42,2 мкг/кг соответственно) и оказывают летальный эффект на прибрежных крабов (в дозе 4 мкг/кг и 82 мкг/кг соответственно) (таблица).

Тестирование полученных фракций полипептидов на млекопитающих показало, что фракция нейротоксина RTX-III оказалась менее токсичной на крабах и личинках, чем полипептиды суммарной фракции RTX-I + RTX-II.

Эти результаты подтверждают данные ранних исследований о том, что более токсичные на млекопитающих токсины оказывают меньший токсический эффект на ракообразных [2; 13].

Таблица Токсический эффект нейротоксинов RTX-I — RTX-III на мышах, личинках и крабах ЛД50, ЛД100, ЛД100, Токсин мышь (мкг/кг) [2] краб (мкг/кг) личинка (мкг/кг) 3000±25 4,0±0,12 3,3±0,12 RTX-I + RTX-II 25±1,2 82,0±2,8 RTX-III 42,2±0,2 Для разделения нейротоксинов суммарной фракции RTX-I и RTX-II мы провели дополнительную ВЭЖХ на колонке с обращенно-фазовым носителем Nucleosil C18, в результате которой было получено 8 полипептидных фракций разной степени очистки. Согласно данным масс-спектрометрического анализа молекулярные массы полипептидов полученных фракций варьировали от 4300 до 5500 Да. Полипептиды с молекулярными массами 5000—5500 Да принадлежат, вероятно, к группе нейротоксинов, о чем свидетельствует также величина их токсичности, а пептиды с молекулярной массой 4300—4800 Да могут представлять собой APETx2-подобные токсины [8; 3]. Узкий диапазон значений молекулярных масс предполагает, что нейротоксины в обеих группах являются высокогомологичными изоформами, о чем свидетельствуют результаты хроматографии, показывающие сложность разделения и получения отдельных полипептидов в гомогенном состоянии. Поэтому можно предположить, что, подобно ингибиторам Кунитц-типа [11; 10] и актинопоринам H. crispa [6], данные нейротоксины (в двух группах) являются представителями мультигенных семейств, образующих так называемые комбинаторные библиотеки актинии H. crispa.

Рисунок 3. Профиль элюции, полученный при разделении суммарной полипептидной фракции RTX-I и RTX-II на колонке Luna 5u C18 (10250 мм), уравновешенной 10 %-ным ацетонитрилом в 0,1 % трифторуксусной кислоте.

Элюцию осуществляли сначала в градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 40 % (30 мин) и затем в изократическом режиме 40 %-ным ацетонитрилом в 0,1 % трифторуксусной кислоте, рН 2,2 за 60 минут. Скорость элюции — 3,0 мл/мин. Отмечены границы объединения фракций Таким образом, нейротоксины актинии H. crispa, действующие не только на млекопитающих и ракообразных, но и на насекомых, представляют собой комбинаторные библиотеки высокогомологичных полипептидов, которые отбирались в ходе дивергентной эволюции (за счет точечных мутаций аминокислотных остатков) для взаимодействия с различными биологическими мишенями. Следовательно, тропическая актиния широко H. crispa, распространенная в Индийском и Тихом океанах, является перспективным источником таких биологически активных соединений, которые можно рассматривать в качестве «ведущих» токсических и инсектотоксических компонентов, а также использовать в фармакологических целях для создания на их основе кардиостимулирующих агентов [12].

Рисунок 4. Масс-спектры полипептидов, присутствующих в белковых фракциях пиков 1(А), 4 (Б) и 6 (В)

Список литературы:

Байдан Л.B., Козловская Э.П., Еляков Г.Б., Тишин С.М. Действие 1.

анемонотоксина на нервно-мышечную передачу в скелетных и гладких мышцах // Докл. АН СССР. — 1981. — Т. 259. — № 4. — С. 1000—1002.

Зыкова Т.А. Исследование первичной структуры биологически активных 2.

пептидов актинии Radianthus macrodactylus: Диссертация… канд. хим.

наук. — Владивосток. 1987. — С. 130.

Козлов С.А., Осмаков Д.И., Андреев Я.А. и др. Полипептидный токсин 3.

из морской анемоны ингибирующий протон-чувствительный канал ASIC3 // Биоорган. химия. — 2012. — Т. 38, № 6. — С. 653—659.

Махнырь В.М., Козловская Э.П. Модификация нейротоксина RTX-III 4.

из морской актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. — 1990. — Т. 16. — № 5. — С. 643—648.

Монастырная М.М., Лейченко Е.В., Гладких И.Н. и др. Полипептиды 5.

актиний, взаимодействие с биологическими мишенями // Вестник ДВО РАН. — 2014. — № 1. — С. 103—119.

Ткачева Е.С., Лейченко Е.В., Монастырная М.М. и др. Новые 6.

актинопорины актинии Heteractis crispa: клонирование и функциональная экспрессия // Биохимия. — 2011. — Т. 76. — Вып. 10. — С. 1387—1397.

7. Bosmans F., Aneiros A., Tytgat J. The sea anemone Bunodosoma granulifera contains surprisingly efficacious and potent insect-selective toxins // FEBS Letters. — 2002. — Vol. 532. — P. 131—134.

8. Diochot S., Baron A., Rash L.D., Deval E., Escoubas P., Scarzello S., Salinas M., and Lazdunski M. A new sea anemone peptide, APETx2, inhibits ASIC3, a major acid-sensitive channel in sensory neurons // EMBO J. — 2004. — Vol. 23. — P. 1516—1525.

Frazo B., Vasconcelos V., Antunes A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, 9.

Actiniaria) toxins: an overview // Mar. Drugs. — 2012. — Vol. 10. — P. 1812—1851.

10. Gladkikh I., Monastyrnaya M., Leychenko E. et al. A typical Reactive Center Kunitz-Type Inhibitor from the Sea Anemone Heteractis crispа // Mar. Drugs. — 2012. — Vol. 10. — P. 1545—1565.

11. Isaeva M., Chausova E., Zelepuga E. et al. A New Multigene Superfamily of Kunitz-Type Protease Inhibitors from Sea Anemone Heteractis crispa // Peptides. — 2012. — Vol. 34. — P. 88—97.

12. Norton T.R. Cardiotonic polypeptides from Anthopleura xanthogrammica (Brandt) and A. elegantissima (Brandt) // Feder. Proc. — 1981. — Vol. 40. — P. 21—25.

13. Schweitz H., Vincent J.P., Barhanin J. et al. Purification and pharmacological properties of eight sea anemone toxins from Anemonia sulcata, Anthopleura xanthogrammica, Stoichactis giganteus, and Actinodendron plumosum // Biochemistry. —1981. — Vol. 20. — P. 5245—5252.

14. Williams R.B. Acrorhagi, catch tentacles and sweeper tentacles: a synopsis of ‘aggression’ of actiniarian and scleractinian Cnidaria // Hydrobiologia. — 1991. — Vol. 216/217. — P. 539—545.



Похожие работы:

«SCIENTIFIC ARTICLES. ECOLOGY 2006 ISBN 954-9368-16-5 ВОСТОЧНО-УРАЛЬСКИЙ РАДИОАКТИВНЫЙ СЛЕД: СОВРЕМЕННЫЕ УРОВНИ РАДИОАКТИВНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ Вера Н. Позолотина, Елена В. Антонова и Инна В. Молчанова Институт эко...»

«Научно-исследовательская работа Тема: "Минеральные эликсиры: миф или реальность"Выполнил: Зуйков Иван Алексеевич, учащийся 6Б класса МБОУ гимназия "Пущино"Руководитель: Зуйкова Ольга Викторовна, учитель биологии МБОУ гимназия "Пущино" Оглавление 1. Введение..3 2. Основная часть..6 2.1. Обзо...»

«Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Методические указания к контрольным работам и варианты контрольных работ для студентов заочного отделения медици...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТРОИТЕЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ НАУЧНО-ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ Материал ПО ИЗУЧЕНИЮ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ г. МОСКВЫ В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОМ КЛАССЕ НА БАЗЕ МГСУ для учащихся средних школ г. Москвы по инженерной специальности "Экология городской с...»

«Научные записки природного заповедника "Мыс Мартьян" 113 Вып. 3, 2012. – Флора и растительность ЭКОЛОГО-ФИТОЦЕНОТИЧЕСКИЙ ДИАПАЗОН PULSATILLA TAURICA JUZ. НА ЯЙЛАХ КРЫМА В.Н. Голубев Никитский ботанический сад – Национальный научный центр УААН Изучение эколого-фитоценотической приуроче...»

«Проект Bioversity International/UNEP-GEF "In Situ/On farm сохранение и использование агробиоразнообразия (плодовые культуры и их дикорастущие сородичи) в Центральной Азии" К.С. Ашимов ФАКТОРЫ СНИЖЕНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ОРЕХОВО-П...»

«2 1. Аннотация Кандидатский экзамен по специальной дисциплине для аспирантов специальности 03.03.01физиология проводится кафедрой "Физиологии и этологии животных". Общая трудоемкость кандидатского экзамена составляет 1 зачетную единицу, 36 часов самостоятельной работы аспиранта.2. Содержание кандидатского экзамена 1. Общие положения Ф...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО" Кафедра микробиологии и физиологии...»

«574: 630*181 УДК. Радиальный прирост и возрастная структура высокогорных лиственничников Кузнецкого Алатау 03.00.16экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург 2002 Работа выполнена на кафедре ботаники и защиты леса Уральского государственного лесатехнического универс...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.